机械敏感性脂质爬行酶TMEM63B的C末端尾部自抑制

《Journal of Biological Chemistry》：Autoinhibition of the mechanosensitive lipid scramblase TMEM63B by its C-terminal tail

　　

TMEM63B属于OSCA/TMEM63机械敏感性离子通道家族。研究人员近期将其鉴定为一种由膜物理性质变化激活的机械敏感性脂质爬行酶（lipid scramblase）。冷冻电镜（Cryo-EM）分析显示，重组小鼠TMEM63B（mTMEM63B）蛋白根据去垢剂环境呈现闭合或开放构象，且单克隆抗体YN9303-24可稳定开放状态；然而，该抗体的表位及其依赖性构象调控机制尚不清楚。本研究利用嵌合构建体、C末端截短及内部缺失突变，将YN9303-24表位定位至胞内C末端尾部，并确定AQV基序（第773–775位残基）为核心结合决定簇。功能分析揭示，该C末端区域对于维持静息状态下TMEM63B的非活性状态至关重要。缺失相邻的LQD基序（Δ776–778）或将其中的Leu776替换为丙氨酸（Ala）可诱导强烈的组成型脂质爬行活性，表现为磷脂酰丝氨酸（PS）外翻及荧光标记磷脂酰胆碱（NBD-PC）的摄取增加，而Gln777或Asp778的替换则影响甚微。结构分析将AQVLQD基序定位至开放构象中保守的胞内螺旋附近，且Leu776邻近多个疏水残基。综上，这些发现揭示了C末端尾部区域在维持TMEM63B非活性状态中的自抑制（autoinhibitory）作用，提示该尾部与胞内螺旋之间的相互作用调控了这种机械敏感性脂质爬行酶的活性。

生物膜磷脂不对称性由ATP依赖的flippases（IV型P型ATP酶）维持，而ATP非依赖的脂质爬行酶（lipid scramblase）可迅速破坏这种不对称性，参与凋亡细胞清除、血液凝固等过程。哺乳动物中已知两类主要爬行酶家族：XKR8（凋亡时被caspase切割激活）和TMEM16（部分直接结合Ca²⁺并发挥Ca²⁺激活的脂质爬行功能）。TMEM16蛋白与OSCA/TMEM63机械敏感性离子通道和TMC（transmembrane channel-like）家族结构相似。研究人员前期发现，TMEM63B（一种机械敏感性脂质爬行酶）在细胞实验和无细胞系统中均表现出脂质爬行活性，其活性可由甲基β-环糊精（MβCD）和磷脂酶处理诱导，即响应膜物理性质变化。冷冻电镜（Cryo-EM）分析表明，在LMNG–CHS去垢剂中重组小鼠TMEM63B（mTMEM63B）处于闭合构象，而在DDM–CHS中仅当存在单克隆抗体YN9303-24时转变为开放状态，但抗体表位及抗体依赖性构象调控机制未知。为解决此问题，研究人员利用嵌合、截短和缺失突变体结合功能分析，定位了YN9303-24表位并揭示了C末端尾部的自抑制功能。论文发表在《Journal of Biological Chemistry》。

本研究得以下关键结论：C末端尾部AQV基序（773–775）为YN9303-24表位的核心结合决定簇；C末端尾部（尤其Leu776）对维持TMEM63B非活性状态至关重要；缺失LQD基序或L776A突变导致组成型脂质爬行活性；开放构象中AQVLQD基序邻近保守胞内螺旋（IL2H2和IL2H3），Leu776与多个疏水残基相互作用。这些发现阐明了C末端尾部作为自抑制元件调控TMEM63B活性的机制。

研究方法中主要关键技术包括：利用HEK293T细胞（ATCC来源）和逆转录病毒系统建立稳定表达Tmem63b^null Ba/F3细胞系（Ba/F3为小鼠IL-3依赖前B细胞系，Tmem63b^null由研究人员前期构建）；流式细胞术检测抗体结合（YN9303-24与细胞结合）及Annexin V染色以评估磷脂酰丝氨酸（PS）暴露；荧光标记磷脂酰胆碱（NBD-PC）摄取实验测定脂质爬行活性；Western blotting检测蛋白表达水平；共聚焦显微镜观察EGFP或HA标记蛋白的亚细胞定位；实时定量RT-PCR检测mRNA表达；利用前期冷冻电镜结构（PDB: 8WG4）进行结构分析。所有检测均以多西环素（SYTOX Blue）排除死细胞。

**Identification of the YN9303-24 mAb epitope**
通过流式细胞术分析，在saponin通透条件下，野生型mTMEM63B及C末端截短至778残基（m63B-778）仍与YN9303-24结合，但截短至775残基（m63B-775）结合减少约50%，进一步截短完全丧失结合。内部缺失突变体Δ773–781（缺失AQVLQDSEG）及更大缺失片段结合消失，而Δ776–778（缺失LQD）保留结合。结合嵌合构建（hTMEM63A与hTMEM63B的N/C末端交换），确定AQV基序（773–775）为抗体核心表位。

**Critical role of the C-terminal tail in maintaining the inactive state of TMEM63B lipid scramblase**
在Tmem63b^null细胞中表达HA标签的mTMEM63B突变体，表面表达检测确认70–75%野生型水平。流式细胞术Annexin V染色显示，Δ776–778突变体（缺失LQD）在静息状态下即可强烈暴露PS，且NBD-PC摄取显著增加，表明组成型脂质爬行活性。精细丙氨酸扫描发现，Leu776位丙氨酸替换（L776A）即可诱导组成型活性，而Gln777或Asp778替换几乎无影响。Leu776为维持TMEM63B非活性状态的关键残基。

在讨论中，研究人员指出，闭合态结构中C末端尾部（含AQVLQD基序）密度不可见，提示非活性状态下该区域高度灵活；而在DDM–CHS开放态结构中（与YN9303-24共存），AQVLQD基序位于IL2H2和IL2H3螺旋附近，Leu776与IL2H2的Tyr276、Val278、Leu281及IL2H3的Val354等疏水残基毗邻，暗示该基序通过疏水相互作用与横梁结构域（beam-like domain）结合。抗体结合稳定此构象，而C末端尾部与横梁结构域的瞬时接触有助于维持非活性状态。膜结构变化可改变这些相互作用，导致脂质转运通路开放。此外，Leu776–横梁结构域相互作用对mTMEM63B表达至关重要，表明C末端尾部接触也调控蛋白折叠。综上，C末端尾部本质上是自抑制元件，维持TMEM63B非活性状态同时支持蛋白折叠。但研究人员不能完全排除AQVLQD基序与其他蛋白瞬时相互作用的可能性，例如mTMEM63B与mSLC19A2的结合报道。未来需在天然膜环境中获得高分辨率结构以解析尾部介导的调控动力学。

研究结论翻译：总之，C末端尾部本质上作为一个自抑制元件（autoinhibitory element），在维持TMEM63B非活性状态的同时也支持蛋白折叠，该尾部与胞内螺旋之间的相互作用调控了这种机械敏感性脂质爬行酶的活性。