《Journal of Biological Chemistry》：Ginkgolide A Enhances Cardiomyocyte Differentiation from Pluripotent Stem Cells by Targeting Cytochrome c to Attenuate Intrinsic Apoptosis
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摘要：多能干细胞(pluripotent stem cells, PSCs)高效分化为功能细胞是再生医学与生物制造的关键，但常受细胞凋亡阻碍。银杏内酯A(Ginkgolide A, GA)是从银杏(Ginkgo biloba)叶中提取的二萜内酯，属银杏内酯家族
摘要：多能干细胞(pluripotent stem cells, PSCs)高效分化为功能细胞是再生医学与生物制造的关键，但常受细胞凋亡阻碍。银杏内酯A(Ginkgolide A, GA)是从银杏(Ginkgo biloba)叶中提取的二萜内酯，属银杏内酯家族，已知具有神经保护与心血管调节等生物学活性，但其对干细胞定向分化的影响机制尚不清楚。本研究利用CRISPR-Cas9工程化TNNT2-mCherry报告PSCs系及既定心肌分化方案，筛选银杏内酯对心肌细胞产量的影响。结果显示GA显著提高了心肌细胞诱导效率并加速了自发性搏动的起始时间；同时GA有效抑制分化过程中的凋亡，RNA测序(RNA-seq)揭示GA阶段特异性上调抗凋亡基因(如MCL1、XIAP)及核心心脏发育转录因子(NKX2-5、GATA4)。分子对接预测GA与细胞色素c(Cytochrome c, CYCS)具有高结合潜力，提示GA可能通过干扰细胞色素c与凋亡蛋白酶激活因子-1(apoptotic peptidase activating factor-1, APAF-1)的结合抑制内源性线粒体凋亡级联反应。上述结果表明GA通过抗凋亡作用增强PSCs向心肌细胞的分化，可作为安全培养添加剂用于大规模生物制造与组织工程中以提升细胞存活率与产量。
论文解读：银杏内酯A通过靶向细胞色素c抑制内源性凋亡促进多能干细胞心肌分化
缺血性心脏病尤其是心肌梗死(myocardial infarction, MI)是全球主要致死病因，成人心肌细胞(cardiomyocyte, CM)再生能力极有限，人多能干细胞(human pluripotent stem cell, hPSC)来源的心肌细胞(hPSC-CMs)被认为是补充受损心肌的重要种子细胞。尽管现有体外定向分化方案在实验条件下可获得较高效率，但在临床转化与规模化生产中仍面临两大瓶颈：分化效率偏低，以及分化过程中大量细胞发生凋亡(apoptosis)导致终产品严重损失。分化早期由多能态向心脏谱系特化的过渡阶段极易触发程序性细胞死亡，特别是内源性线粒体凋亡途径(intrinsic mitochondrial apoptosis pathway)，显著制约最终可用细胞得率。银杏(Ginkgo biloba)叶中的纯化二萜内酯——银杏内酯A(Ginkgolide A, GA)已被报道具有心脏保护作用及通过PI3K/Akt通路、内质网应激缓解等方式抑制神经元和内皮细胞凋亡，但GA是否直接影响PSC来源心肌细胞分化及其分子机制尚未阐明。本研究假设GA凭借其心脏保护及抗凋亡特性可提高多能干细胞心肌分化产出，通过表型筛选、转录组学及计算生物学手段探究GA的作用与机制，论文发表于《Journal of Biological Chemistry》。
为开展研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在hPSC的TNNT2基因终止密码子前敲入H2B-mCherry-PuroR构建TNNT2-mCherry报告细胞系用于实时示踪心肌分化；采用化学限定分阶段诱导方案将hPSC经中胚层(mesoderm)、心脏中胚层(cardiac mesoderm)、心脏祖细胞(cardiac progenitor cell, CPC)定向分化为心肌细胞；以Annexin V与活化Caspase-3双染结合流式细胞术检测凋亡率，Western blot检测Cleaved Caspase-9/-3、Cleaved PARP、BCL2及BAX等凋亡相关蛋白；对GA处理组与对照组在心脏中胚层(Day 4)、心脏祖细胞(Day 5)及早代心肌细胞(Day 6)进行转录组测序(RNA-seq)并进行差异表达基因(DEG)、基因本体论(Gene Ontology, GO)、基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis, GSEA)及KEGG通路富集分析；采用PharmMapper与DrugCLIP进行反向药效团匹配预测GA潜在靶点，利用AutoDock Vina进行GA与细胞色素c(Cytochrome c, CYCS)的分子对接(molecular docking)，并用AlphaFold 3预测CYCS与APAF-1复合物结构以评估GA对CYCS/APAF-1互作界面的影响。
Cardiomyocytes Derived from Human Pluripotent Stem Cells
研究人员按照改良化学限定方案将hPSC经CHIR99021+BMP4/Activin A/bFGF诱导中胚层（Day 2高表达MIXL1、MESP1、TBXT），IWR-1+视黄酸诱导心脏中胚层（Day 4高表达ISL1、MESP1），再加BMP4/FGF10促CPC形成（Day 6高表达NKX2-5、ISL1、GATA4、TBX5及TNNT2），Day 8~14获得具节律性收缩的成熟心肌细胞，经免疫荧光、qRT-PCR及透射电镜证实典型肌节结构与亚细胞器成熟特征，证明本分化体系可稳定产生hPSC来源心肌细胞。
TNNT2 Reporter Cell Line
研究人员通过CRISPR-Cas9在hPSC的TNNT2位点knock-in H2B-mCherry-PuroR，获得TNNT2-mCherry报告株。流式细胞术显示Day 10心肌诱导效率＞80%，与未编辑hESC相当；qRT-PCR证实各阶段标志物表达正常；免疫荧光显示mCherry（核定位，H2B标签）与TNNT2、NKX2-5、ISL1共定位，证明成功构建可用于实时追踪心肌分化的报告细胞系。
Screening Ginkgo Chemical Components for Effects on Cardiomyocyte Induction Using the Reporter Line
研究人员用报告系统筛查Ginkgolide A(GA)、Ginkgolide B(GB)、Ginkgolide K(GK)（50 μM与100 μM）对心肌诱导效率的影响，发现GA与GB显著提高TNNT2?细胞比例，GK无显著影响；其中GA（100 μM、150 μM）可使首次自发搏动提前至Day 5，并显著上调心脏转录因子NKX2-5及TNNT2蛋白表达，确定GA为促进心肌分化的有效银杏内酯组分。
Ginkgolide A Inhibits Apoptosis During Stem Cell Differentiation
研究人员在Day 5检测发现对照组凋亡细胞（Annexin V?/Caspase-3?双阳性）占34.2%，100 μM与150 μM GA组分别降至16.8%与8.5%；GA剂量依赖性降低Cleaved PARP、Cleaved Caspase-9、Cleaved Caspase-3与总蛋白比值，但不改变BCL2/BAX总蛋白水平。GA显著提升Day 4心脏中胚层标志MESP1及Day 5 CPC标志NKX2-5、ISL1表达；但200 μM GA抑制MESP1、ISL1、GATA4表达，表明适度凋亡是谱系特化的生理所需，完全阻断有害。结论：GA通过抑制Caspase-3活化削减内源性凋亡，提高心脏中胚层与CPC生成。
RNA-seq Analysis of GA-Treated PSC-Derived Cardiomyocytes at Different Stages
研究人员对Day 4/5/6样本行RNA-seq，PCA显示GA对未分化PSC转录组几无影响，在心脏中胚层及后续阶段显著改变表达谱。差异基因聚类富集"发育/形态发生相关凋亡过程负调控"等GO条目；GSEA显示GA处理组CPC与早代CM中凋亡相关通路显著富集，且主导基因为MCL1、XIAP、BIRC5、BCL2L1等抗凋亡基因，即"凋亡通路富集"伴随实际凋亡执行减弱。GA还上调核心心脏发育转录因子NKX2-5、TBX5、GATA4等，KEGG富集涉及干细胞多能性调控、染色质重塑、肌细胞骨架及氨基酸代谢。结论：GA在分化期阶段特异性上调抗凋亡基因并协同激活心脏发生(cardiomyogenesis)程序，通过双重作用维持存活并促进谱系定向。
Molecular Docking Predictions
研究人员经反向药效团匹配与富集筛选出细胞色素c(CYCS)为候选靶标。AutoDock Vina对接显示GA与CYCS结合自由能-5.4 kcal/mol，GA的C10位羰基氧(O9)与CYCS Lys27（形成氢键距离≈3.2 ?）、Ser15（氢键≈3.05 ?）相互作用，并有疏水接触(Lys7、Phe10、Ile11、Thr19)。AlphaFold 3预测的CYCS-APAF-1界面关键残基含Lys25、Lys27等，GA结合位点与CYCS/APAF-1互作面重叠或邻近，提示GA作为竞争性抑制剂干扰CYCS与APoptotic Peptidase Activating Factor-1(APAF-1)结合，阻碍凋亡体(apoptosome)组装及下游Caspase活化。
讨论总结（结论部分翻译）
研究表明GA是一种来源于传统药食同源植物银杏的天然二萜内酯，可通过直接结合细胞色素c并干扰其与APAF-1的蛋白-蛋白相互作用，抑制内源性线粒体凋亡途径的启动；与此同时GA阶段特异性上调抗凋亡基因(MCL1、XIAP等)及核心心脏发育转录因子(NKX2-5、GATA4等)，在分化关键窗口营造促存活-促分化微环境，从而显著提高多能干细胞向心肌细胞的诱导效率与最终活细胞得率。过高浓度(200 μM)完全阻断发育所需的基础凋亡则损害心脏谱系特化，说明GA需在适宜浓度窗口发挥作用。该工作不仅揭示了GA调控细胞命运决定的新机制——在蛋白水平干扰CYCS/APAF-1互作并在转录水平巩固抗凋亡与心脏发生程序，且证明GA作为植物源、安全性可接受的培养基添加剂，可有效降低生物反应器分化过程中的细胞损耗、提升产量，为基于天然产物的高效可持续细胞农业技术体系提供候选工具与科学依据。GA在hPSC阶段不影响多能性转录组，其主要作用于中胚层向心脏谱系转换期，符合分化诱导凋亡高峰期的干预逻辑。后续需通过生物物理实验直接验证GA与CYCS的结合及对CYCS-APAF-1解离常数的影响。
