一种基于趋化因子“调控机制”的仿生纳米制剂通过重塑免疫细胞微环境，增强了CAR-T细胞对实体瘤的疗效

《Journal of Controlled Release》：A chemokine “leverage regulation” biomimetic nanoformulation enhances CAR-T cells against solid tumors by reshaping immune cell niches

　　

赵秀|赵凯凯|易梦飞|杨若涵|崔旭阳|张毅|李峰|刘俊杰

郑州大学第一附属医院生物治疗中心，中国郑州450052

摘要

驱动异常免疫细胞生态位的肿瘤趋化因子在阻碍嵌合抗原受体（CAR）-T细胞治疗实体瘤方面起着关键作用。本文开发了一种具有趋化因子“调节杠杆”能力的仿生纳米制剂，该制剂能够建立匹配的迁移信号，以创建支持CAR-T细胞治疗的免疫细胞生态位。该系统使用载有塞来昔布（CXB）的聚（d,l-乳酸-共-羟基乙酸）（PLGA）纳米颗粒构建，并随后用高CXCR4表达的间充质干细胞膜进行伪装。利用肿瘤异常上调趋化因子CXCL12以招募CXCR4阳性免疫抑制细胞的特性，这种仿生纳米制剂可以在肿瘤组织中有效积累。这些纳米制剂通过上调免疫原性趋化因子（CXCL9、CXCL10）来选择性招募CAR-T细胞，同时作为纳米诱饵中和CXCL12，从而减少免疫抑制细胞（如CAR-Tregs和MDSCs）的流入，增强CAR-T细胞的杀伤效果。这种对趋化因子网络的双重调节显著提高了CAR-T细胞治疗实体瘤的疗效。我们的方法为推进CAR-T细胞治疗在实体瘤中的临床应用提供了一种有前景的策略。

引言

嵌合抗原受体（CAR）-T细胞治疗在血液系统恶性肿瘤的治疗中取得了显著的临床成功[1]、[2]。然而，其对实体瘤的疗效仍不令人满意[3]。大多数针对实体瘤的CAR-T疗法仍处于I/II期试验阶段，临床研究报告的总体响应率仅为约9%[4]、[5]。实体瘤面临许多血液系统恶性肿瘤所没有的挑战[3]。例如，在某些小鼠模型中，只有不到2%的CAR-T细胞成功渗透到实体瘤中。此外，即使CAR-T细胞进入肿瘤组织，由于主要由髓系来源的抑制细胞（MDSCs）和调节性T细胞（Treg细胞）构成的免疫抑制性肿瘤微环境（TME）的存在，它们仍然无法有效杀死肿瘤细胞[6]、[7]、[8]。这些免疫抑制细胞消耗必需氨基酸并分泌大量免疫抑制性细胞因子，抑制CAR-T细胞的增殖并导致CAR-T细胞耗竭[9]、[10]。因此，促进CAR-T细胞渗透的同时抑制免疫抑制细胞的招募，以重塑肿瘤免疫细胞生态位，对于开发有效的CAR-T疗法至关重要。

趋化因子在介导免疫细胞向肿瘤组织迁移中起着决定性作用[11]、[12]、[13]。然而，实体瘤内趋化因子的表达失调会导致促肿瘤免疫细胞生态位的形成。例如，肿瘤会下调吸引细胞毒性CAR-T细胞的免疫刺激性趋化因子（如CXCL9和CXCL10），从而阻碍CAR-T细胞的招募[14]。相反，吸引免疫抑制性Treg细胞和MDSCs的趋化因子（如CXCL12）则上调，进一步削弱CAR-T细胞的细胞毒性，最终导致免疫逃逸[9]、[16]。因此，实体瘤中不匹配的迁移信号是CAR-T细胞有效渗透和功能的主要障碍[17]。已经探索了几种策略来调节趋化因子水平以改善CAR-T疗法，包括应用表达CXCL9的溶瘤病毒或装载CXCL9/10编码质粒的非病毒载体来增强治疗性趋化因子，或用抗体中和CXCL12[18]、[19]、[20]。然而，这种单方面的调节对CAR-T疗效的改善非常有限[21]。同时增强CAR-T细胞的招募并抑制免疫抑制细胞的渗透是治疗成功的关键要求，特别是考虑到CAR-T细胞产品通常含有免疫抑制性的CAR-Treg细胞[22]。

在这里，我们提出了一种趋化因子“调节杠杆”策略，以重塑肿瘤趋化因子生态位，从而增强CAR-T细胞治疗实体瘤的效果。据报道，塞来昔布（CXB）可以通过抑制环氧化酶-2/前列腺素-E2途径来缓解对CXCL9和CXCL10表达的抑制，从而提高肿瘤组织中免疫原性趋化因子CXCL9和CXCL10的水平[23]、[24]。因此，本研究使用FDA批准的广泛用于体内药物递送的聚合物聚（d,l-乳酸-共-羟基乙酸）（PLGA）来装载CXB（方案1A）。此外，PLGA-CXB纳米颗粒用高CXCR4表达的间充质干细胞（MSCs）膜进行伪装，构建出仿生纳米制剂（PLGA-CXB@CM）。静脉注射后，高CXCR4的PLGA-CXB@CM可以响应CXCR4-CXCL12趋化因子信号轴在肿瘤组织中有效积累。同时，它作为纳米诱饵捕获CXCL12，从而减少免疫抑制细胞的渗透并防止CAR-T细胞失活。此外，释放的CXB上调CXCL9和CXCL10的水平，促进施用的CAR-T细胞有效地渗透到肿瘤中（方案1B）。因此，这些仿生纳米制剂显著增强了CAR-T细胞的治疗效果。

章节片段

材料

PLGA（50:50）0.65 dL/g购自Ruxibio有限公司。塞来昔布购自Solarbio。Fe₃O₄ NP购自上海Aladdin生化技术有限公司。Cy5-SE购自MCE。CXCL12购自PeproTech。D-荧光素钾盐购自J&K Scientific有限公司。人CXCL9、CXCL10、CXCL12 ELISA试剂盒购自Muti Science。山羊抗兔IgG H&L（Alexa Fluor? 594）、抗钠钾ATP酶、抗CXCR4抗体购自

PLGA-CXB@CM纳米制剂的制备和表征

为了开发用于“调节”肿瘤趋化因子的PLGA-CXB@CM，首先合成了封装CXB的PLGA纳米颗粒（NPs）。使用高效液相色谱法（HPLC）量化了PLGA-CXB NPs的药物装载量和封装效率。如图1A和S1所示，当CXB与PLGA的质量比为0.05时，CXB的装载量达到最大值。这一最佳投料比被选用于所有后续的PLGA-CXB制剂制备。透射电子显微镜

结论

CRediT作者贡献声明

赵秀：方法学、资金获取。赵凯凯：撰写——原始草案。易梦飞：研究。杨若涵：研究。崔旭阳：形式分析。张毅：监督。李峰：监督。刘俊杰：资金获取。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

国家自然科学基金（编号：82373287、82504706）、河南省青年科学基金（编号：252300421582）和中国博士后科学基金（编号：2024M763014）的支持。作者感谢郑州大学现代分析与计算中心提供的技术支持。