益气活血方通过cGMP/PKG信号通路调节线粒体相关膜（MAMs）和钙稳态促进心肌梗死后血管生成

《Journal of Ethnopharmacology》：Yiqi Huoxue Formula Promotes Post-Myocardial Infarction Angiogenesis by Modulating Mitochondria-Associated Membranes (MAMs) and Calcium Homeostasis via the cGMP/PKG Signaling Pathway

　　

民族药理学相关性：治疗性血管生成是心肌梗死（MI）后恢复的有前景策略。益气活血方（YQHX）是一种著名的中药复方，临床上广泛用于治疗心肌缺血并改善心肌梗死患者的心功能。本研究旨在阐明YQHX通过cGMP/PKG信号通路调节线粒体相关膜（MAMs）在促进心肌梗死后血管生成和恢复心功能中的调控作用。

材料与方法：通过结扎大鼠左前降支（LAD）冠状动脉建立MI体内模型，并利用缺氧诱导的人脐静脉内皮细胞（HUVECs）建立体外模型。评估YQHX对心功能和HUVEC行为（增殖、迁移和管腔形成）的影响。使用HE/马松染色和生化指标评估心肌组织病理学和内皮损伤。通过血小板内皮细胞黏附分子-1（PECAM-1/CD31）免疫荧光观察梗死边缘区的血管生成。利用透射电子显微镜（TEM）观察MAMs、内质网（ER）和线粒体的超微结构变化。使用荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）和钙离子（Ca²⁺）水平。进行转录组测序以鉴定关键治疗通路，随后通过ELISA、Western blotting和免疫荧光验证cGMP/PKG轴和MAMs相关蛋白（包括cGMP、PKG、IP3R2、GRP75、FUNDC1、VDAC1、CYPD和MCU）。

结果：超声心动图和生化分析表明，高剂量YQHX在保护心功能和减轻心肌损伤方面的效果与一线临床药物培哚普利相当。免疫荧光显示，MI组梗死边缘区出现紊乱和功能失调的毛细血管增生，而YQHX治疗促进了有序功能性微血管的形成。TEM显示MI后MAMs超微结构显著破坏。此外，MI组织和缺氧HUVECs中IP3R2与VDAC1的共定位显著减少，YQHX逆转了这种效应。转录组分析将cGMP/PKG通路鉴定为关键机制。YQHX激活该通路恢复了MAMs结构完整性并修复受损的胞质Ca²⁺信号，TEM、Western blotting、三重标记免疫荧光和钙离子检测验证了这一点。因此，YQHX介导的MAMs修复增强了HUVEC的增殖、迁移和血管生成能力。

结论：本研究证明MI/缺氧通过破坏MAMs的结构和功能完整性损害内皮功能。YQHX通过cGMP/PKG信号轴有效保护MAMs结构并恢复细胞内Ca²⁺信号，从而促进MI后血管生成并改善心功能。这些发现确定了MI的新治疗靶点，并突显了中药复方在调节亚细胞器相互作用方面的独特优势。然而，鉴于植物材料的固有变异性，这些机制性发现基于单一验证批次，未来需要进行多批次标准化。

心肌梗死（MI）是全球范围内导致心力衰竭和死亡的主要原因。尽管经皮冠状动脉介入治疗（PCI）和冠状动脉旁路移植术（CABG）是恢复心肌血供的标准干预手段，但其术后主要不良心血管事件（MACE）发生率仍高达19.2%~22.0%，且血运重建可能引发再灌注损伤，加重心肌细胞凋亡和微血管功能障碍。因此，探索促进内源性心肌修复和建立功能性侧支循环的新策略成为心血管研究的前沿。治疗性血管生成——诱导梗死边缘区形成有效侧支循环——被视为改善心肌灌注、修复损伤组织和逆转心室重构的理想途径。近年来，细胞器对话在调节细胞功能中的关键作用备受关注，其中线粒体相关膜（MAMs）作为线粒体与内质网（ER）之间的动态物理连接和功能交流平台，被确认为调节内皮能量代谢、钙离子（Ca²⁺）稳态、脂质转运和凋亡的核心枢纽。MAMs的结构完整性和功能稳定性直接决定内皮细胞的存活和血管生成能力，其功能障碍与多种心血管疾病的发生密切相关。在众多调控血管生成的信号通路中，环磷酸鸟苷/蛋白激酶G（cGMP/PKG）通路占据中心地位，可能通过调节ER-线粒体Ca²⁺流和能量代谢影响MAMs的稳定性。传统医学将MI视为严重的心脉阻塞，核心病机为“气虚”（能量耗竭）与“血瘀”（微循环障碍）的恶性循环，治疗策略聚焦于“益气活血”。益气活血方（YQHX）是由资深中医医师根据经典方“当归补血汤”化裁的经验方，主要包含黄芪Astragalus mongholicus Bunge、人参Panax ginseng C.A.Mey.、川芎Conioselinum anthriscoides、当归Angelica sinensis (Oliv.) Diels和三七Panax notoginseng。这些植物药在日韩汉方和传统医学中亦用于治疗心血管虚弱，人参更被欧共体草药专论、俄罗斯药典及日美药典收录，三七被定义为“适应原”。临床研究显示YQHX联合西药可显著改善心肌缺血患者的心功能和减少心律失常，现代药理证实其具有抗炎、抗氧化、抑制心肌细胞凋亡和改善微循环等作用。然而，YQHX是否通过调控cGMP/PKG通路和维持MAMs结构完整性促进MI后血管生成尚待阐明。因此，受“恢复细胞能量稳态是重建微循环前提”的民族药理学原理指导，本研究旨在系统探究YQHX促进MI后血管生成的分子机制。该论文发表在《Journal of Ethnopharmacology》。

研究人员为开展研究采用了以下几个主要关键的技术方法：体内模型采用雄性SD大鼠左前降支（LAD）结扎建立心肌梗死模型，体外模型采用人脐静脉内皮细胞（HUVECs）进行缺氧诱导；样本来源为北京中医药大学实验动物中心和细胞库。关键技术包括：超声心动图评估心功能；HE/马森染色及血清生化指标检测心肌损伤和病理重塑；免疫荧光染色（CD31）观察梗死边缘区血管生成；透射电子显微镜（TEM）观察MAMs超微结构；荧光探针检测细胞内活性氧（ROS）和Ca²⁺水平；转录组测序筛选关键信号通路；ELISA、Western blotting和免疫荧光验证cGMP/PKG通路及MAMs相关蛋白（cGMP、PKG、IP3R2、GRP75、FUNDC1、VDAC1、CYPD、MCU）的表达和定位。

**YQHX improves cardiac function, attenuates myocardial injury, and ameliorates pathological remodeling in rats with myocardial infarction（YQHX改善心肌梗死大鼠的心功能、减轻心肌损伤并改善病理重塑）**：通过超声心动图和生化分析发现，高剂量YQHX在保护心功能（射血分数、缩短分数）和减轻心肌损伤（血清肌酸激酶同工酶CK-MB、乳酸脱氢酶LDH水平）方面效果与一线临床药物培哚普利相当。HE和Masson染色显示YQHX减少了心肌坏死面积和胶原沉积，改善了左心室前壁变薄和向外膨出的病理重塑。此外，YQHX促进梗死边缘区有序功能性微血管的形成（CD31免疫荧光），而模型组表现为紊乱和功能失调的毛细血管增生。通过透射电镜观察发现，MI后MAMs超微结构显著破坏（线粒体与内质网间距增大、接触面积减少），YQHX治疗恢复了MAMs结构完整性，并增强了MAMs关键蛋白IP3R2与VDAC1的共定位（免疫荧光三重标记）。转录组测序鉴定cGMP/PKG通路为关键机制，进一步实验证实YQHX激活了cGMP/PKG信号轴，上调了cGMP和PKG水平，并调节了MAMs相关蛋白（如提高IP3R2、GRP75、FUNDC1、VDAC1表达，降低CYPD水平），同时恢复了缺氧HUVECs中受损的胞质Ca²⁺信号。功能实验表明YQHX可促进HUVEC的增殖（CCK-8）、迁移（划痕实验）和管腔形成能力，而PKG特异性抑制剂DT-2或GRP75敲低可部分逆转这些效应。

讨论部分总结：MI是全球心力衰竭和死亡的主因，现有血运重建技术因再灌注损伤和再狭窄受限。本研究聚焦YQHX，整合体内外模型、分子生物学和转录组学，首次揭示YQHX通过激活cGMP/PKG信号通路修复MAMs结构和功能，恢复细胞内Ca²⁺稳态，进而促进内皮细胞血管生成。这一发现将中医“益气活血”理论与现代细胞器对话机制相联系，为治疗MI提供了基于MAMs的新靶点。研究结论翻译如下：本研究证明MI/缺氧通过破坏MAMs的结构和功能完整性损害内皮功能。YQHX通过cGMP/PKG信号轴有效保护MAMs结构并恢复细胞内Ca²⁺信号，从而促进MI后血管生成并改善心功能。这些发现确定了MI的新治疗靶点，并突显了中药复方在调节亚细胞器相互作用方面的独特优势。然而，鉴于植物材料的固有变异性，这些机制性发现基于单一验证批次，未来需要进行多批次标准化。