《Journal of Functional Foods》：Dietary oil composition modulates metabolic endotoxemia in an in vitro human intestinal-immune cell model
编辑推荐：
代谢性内毒素血症是指膳食脂质摄入引起的血浆脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)升高，可导致慢性低度炎症。现有证据表明膳食油脂组成与代谢性内毒素血症存在关联，但其因果关系及潜在机制尚不清楚。本研究采用Transwell系统中的体外(in vi
代谢性内毒素血症是指膳食脂质摄入引起的血浆脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)升高，可导致慢性低度炎症。现有证据表明膳食油脂组成与代谢性内毒素血症存在关联，但其因果关系及潜在机制尚不清楚。本研究采用Transwell系统中的体外(in vitro)人肠-免疫细胞模型，考察并比较消化后食用油对反映LPS跨膜易位标志物的影响。将Caco-2单层细胞顶侧暴露于消化后脂质±LPS共24 h，收集基底外侧条件培养基作用于THP-1 Lucia NF-κB巨噬细胞以量化核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)活化。结果显示，棕榈油+LPS共处理诱导最高的巨噬细胞NF-κB活化，而鱼油+LPS和花生油+LPS诱导最小活化。油脂来源的多不饱和脂肪酸(poly-unsaturated fatty acids, PUFAs)与巨噬细胞活化呈负相关，提示潜在的抗炎效应。综上，研究发现膳食油脂组成可调节基底外侧区室的炎症状态，从而可能影响代谢性内毒素血症。
论文解读——《Dietary oil composition modulates metabolic endotoxemia in an in vitro human intestinal-immune cell model》
该研究发表于《Journal of Functional Foods》。代谢性内毒素血症(metabolic endotoxemia)指高膳食脂肪摄入引起血浆革兰氏阴性菌细胞壁成分脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)升高，进而通过结合Toll样受体4(Toll-like receptor 4, TLR4)激活核因子κB(nuclear factor kappa B, NF-κB)信号通路，诱发慢性低度炎症，与2型糖尿病、心血管疾病等非传染性疾病密切相关。已有人群与动物研究表明饱和脂肪酸(saturated fatty acids, SFAs)富集的油脂可升高餐后血浆LPS或其替代标志物LPS结合蛋白(LPS-binding protein, LBP)，而不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acids, UFAs)尤其是ω-3多不饱和脂肪酸(poly-unsaturated fatty acids, PUFAs)与之相反，但膳食油脂组成是否因果性地影响LPS跨肠上皮易位及具体细胞分子机制仍不明确。为此，研究人员选用脂肪酸谱差异显著的五种油脂——棕榈油(SFA富集)、特级初榨橄榄油(extra virgin olive oil, EVOO；单不饱和脂肪酸mono-unsaturated fatty acids, MUFAs富集)、鱼油(ω-3 PUFAs富集)、花生油(MUFAs及亚油酸富集)及高脂奶油(SFA富集，乳制品来源)，经体外(in vitro)胃肠消化后作用于已分化的Caco-2肠上皮细胞单层，联合THP-1 Lucia NF-κB巨噬细胞共培养体系，系统评估不同油脂在LPS共存下对LPS跨肠上皮易位及基底外侧炎症反应的调控作用，并初步探索乳糜微粒分泌、网格蛋白介导的转胞吞及肠型碱性磷酸酶(intestinal alkaline phosphatase, iALP)等可能机制。
主要关键技术方法
研究人员选取未消化棕榈油、EVOO、鱼油、花生油及高脂奶油，按改良INFOGEST方案进行体外(in vitro)胃肠消化制备消化产物。采用已分化的人结肠腺癌Caco-2细胞在Transwell插入式小室形成紧密上皮单层[跨上皮电阻(transepithelial electrical resistance, TEER)>700 Ω·cm2]，顶侧给予1:50稀释的消化后油脂±大肠杆菌O111:B4来源LPS(终浓度0.5 μg/mL，即0.5 mg/L文中按原文表述为0.5 mg/mL需注意此为原文标注，实际工作浓度通常ng级，此处依原文保留)，孵育24 h；基底外侧条件培养基转移作用于已佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)诱导分化的、稳定整合NF-κB诱导型荧光素酶报告基因的人THP-1 Lucia NF-κB巨噬细胞，检测相对荧光素单位(relative luminescence units, RLUs)反映NF-κB活化程度。通过TEER与荧光黄(Lucifer Yellow, LY, 0.4 kDa)旁细胞通透性实验确认上皮屏障完整性；ELISA检测基底外侧载脂蛋白B(apolipoprotein B, APOB)作为乳糜微粒(chylomicron)标记；实时荧光定量PCR(qPCR)检测APOB、脂肪酸结合蛋白2(fatty acid binding protein 2, FABP2)、微粒体甘油三酯转移蛋白(microsomal triglyceride transfer protein, MTTP)及网格蛋白重链(clathrin heavy chain, CLTC)、Disabled同源物2(disabled homolog 2, DAB2)、早期内体抗原1(early endosome antigen 1, EEA1)、Intersectin-1(intersectin 1, ITSN1)、锌指DHHC型含21(zinc finger DHHC-type containing 21, ZDHHC21)等转胞吞相关基因表达；Western-blot/ELISA定量Caco-2细胞匀浆中iALP蛋白并经二辛可宁酸(bicinchoninic acid, BCA)法总蛋白校正；采用气相色谱-火焰离子化检测器(gas chromatography-flame ionization detector, GC-FID)测定未消化油脂脂肪酸组成；用随机区组方差分析(randomized block ANOVA)及Fisher's LSD检验进行统计学处理。
3.1. Fatty acid profiles of palm oil, EVOO, fish oil, peanut oil and high-fat cream
通过GC-FID分析得出各油脂总SFA、MUFA、PUFA百分比：棕榈油SFA约51.2%(主要为棕榈酸C16:0 44.9%)，MUFA约39.9%；EVOO MUFA约73.1%(油酸C18:1 n-9 68.9%)；鱼油PUFA约37.8%(二十碳五烯酸eicosapentaenoic acid, EPA C20:5 n-3 12.9%，二十二碳六烯酸docosahexaenoic acid, DHA C22:6 n-3 10.3%)；花生油MUFA约57.5%、亚油酸C18:2 n-6 22.8%；高脂奶油SFA约66.2%(含短中链脂肪酸及C16:0 28.4%、硬脂酸C18:0 10.2%)。结论：所选油脂具明显区分度的脂肪酸谱，可用于对比研究。
3.2. Digested oils and high-fat cream, with or without LPS, do not compromise permeability in Caco-2 cell monolayers
TEER值(以基线百分比表示)与LY旁细胞通透性在各处理组与消化对照组间无显著差异，均维持上皮屏障完整性。结论：消化后油脂±LPS不破坏Caco-2单层紧密连接，提示后续观察到的基底外侧NF-κB活化源于跨细胞(transcellular)而非旁细胞(paracellular) LPS易位。
3.3. Oil composition differentially modulates NF-κB activation in THP-1 Lucia NF-κB macrophages during lipid-induced metabolic endotoxemia in Caco-2 cells
仅有LPS处理的对照基底外侧培养基引发轻度NF-κB活化；棕榈油+LPS组基底外侧培养基使巨噬细胞NF-κB活化显著高于消化对照+LPS(p<0.0001)；EVOO+LPS组与对照+LPS无差异；鱼油+LPS及花生油+LPS组呈降低趋势；高脂奶油+LPS组与对照无差异。单独油脂(无外加LPS)基底外侧培养基不激活NF-κB，且消化产物本身LPS污染可忽略。WST-1法证实各基底外侧培养基对巨噬细胞存活率无影响。结论：油脂组成在LPS存在时差异化调节Caco-2基底外侧区室炎症状态，棕榈油促炎最强，富含PUFA的鱼油有抑制趋势。
3.4. Lipid composition differentiates oil types, and PUFA content shows an inverse relationship with macrophage NF-κB activation
主成分分析(principal component analysis, PCA)显示植物油聚为一类，高脂奶油与鱼油各自独立聚类；总PUFA含量及PUFA:SFA比向量与NF-κB活化向量反向，Spearman相关分析示PUFA与NF-κB活化ρ=-0.60，PUFA:SFA比与NF-κB活化ρ=-0.67(本样本量未达显著但呈负趋势)。结论：油脂PUFA含量与LPS易位引发的巨噬细胞炎症活化呈潜在负相关，SFA/MUFA偏向油脂则可能促进。
3.5. Oil composition + LPS modulates chylomicron secretion in Caco-2 cells
各油脂+LPS组基底外侧APOB水平均高于消化对照+LPS，棕榈油+LPS组APOB最高(约为对照2倍)；APOB水平与巨噬细胞NF-κB活化无显著相关性(Spearman ρ=0.308, p=0.214)。qPCR显示部分油脂上调APOB、FABP2及MTTP基因表达。结论：油脂组成调节Caco-2乳糜微粒分泌，但APOB分泌量与基底外侧炎症信号不相关，提示乳糜微粒并非本研究条件下LPS跨膜易位的主要载体。
3.6. Modest changes in transcytosis-associated genes following co-exposure of digested oils and LPS in Caco-2 cells
基底外侧条件培养基中细胞外囊泡四跨膜蛋白(tetraspanins) CD81/CD63/CD9低于检测限；qPCR示CLTC、DAB2、EEA1、ZDHHC21表达仅有轻微变化，ITSN1在鱼油+LPS组较对照+LPS显著上调。结论：油脂+LPS对Caco-2细胞网格蛋白介导转胞吞相关基因表达仅产生微弱调节，该途径在本模型短期处理中贡献有限，需进一步研究。
3.7. LPS and oil composition modulate intestinal alkaline phosphatase (iALP) in Caco-2 cell monolayers
LPS单独处理使Caco-2细胞iALP较无LPS对照升高；棕榈油+LPS及高脂奶油+LPS使iALP进一步升高(约2倍于对照+LPS)；鱼油+LPS及花生油+LPS组iALP低于对照+LPS。结论：LPS诱导iALP表达，该响应被SFA富集油脂放大、被PUFA富集油脂削弱，提示iALP可能参与肠上皮对脂质介导LPS易位的代偿性防御或感知。
讨论与结论翻译总结
研究人员讨论指出，棕榈油+LPS最强促进基底外侧NF-κB活化与文献中小鼠灌胃棕榈油升高血浆LBP一致；鱼油+LPS降低活化趋势与猪回肠及小鼠研究中ω-3 PUFAs抑制LPS易位相符；EVOO无显著影响与部分文献一致；花生油和高脂奶油对人代谢性内毒素血症的影响尚待体内验证。上皮屏障未被破坏支持LPS经跨细胞途径易位。乳糜微粒分泌受油脂调节但与基底外侧炎症无关联，与啮齿类研究中门脉系统非乳糜微粒依赖LPS转运为主的观点吻合。iALP在SFA油脂下上调可能为肠上皮感知基底外侧或顶侧LPS负荷后的代偿反应；推测棕榈油高棕榈酸(C16:0)可促进棕榈酰化(palmitoylation)增强脂筏依赖内吞及乳糜微粒组装，形成更稳定含LPS混合微团(mixed micelles)促其吸收，而PUFA油脂形成微团稳定性差使LPS在腔面更易被iALP去磷酸解毒。这些机制有待后续验证。
研究结论：在LPS存在下，膳食油脂组成差异化调节紧密Caco-2单层基底外侧区室炎症状态——SFA及MUFA富集油脂具潜在促炎作用，PUFA富集油脂尤其鱼油具潜在保护/抗炎作用。饱和棕榈油可能通过(1)形成更稳定含LPS混合微团促进LPS吸收及/或(2)棕榈酸介导的棕榈酰化加速细胞内囊泡运输，致基底外侧LPS水平升高，继而上调Caco-2细胞iALP作为代偿并激活巨噬细胞NF-κB；鱼油因高PUFA含量可能对此机制起相反调控。未来需围绕混合微团形成及LPS跨上皮易位具体机制深入研究。
