综述：mRNA-脂质纳米颗粒在基因编辑及免疫应答领域的进展

《Journal of Genetic Engineering and Biotechnology》：Advancements of mRNA-lipid nanoparticle links to gene editing and immune responses

　　

脂质体制剂长期以来被用于递送包括mRNA分子在内的多种生物物质，其中大尺寸脂质在细胞膜的结构与功能中发挥关键作用。mRNA在蛋白质合成过程中承担核心功能，介导蛋白质的表达。这一天然过程支撑了基因编辑、蛋白质替代疗法、癌症免疫治疗、细胞重编程及疫苗研发等领域的应用。目前已有多种生物材料被用于mRNA的递送，包括聚合物、脂质基纳米颗粒及蛋白质-mRNA复合物。本综述旨在分析用于基因编辑的mRNA-脂质纳米颗粒，并探讨其增强针对传染病的免疫应答的机制。基于CRISPR-Cas9基因编辑的非病毒脂质纳米颗粒方法已在多种癌细胞类型中实现体内最高80%、体外最高98%的基因编辑效率。作为预防性HIV疫苗的MEVPCS-mRNA LNPs可通过CD8+T细胞诱导相当水平且具有高度特异性的免疫应答。接种LNP-mRNA的小鼠表现出显著的Th1型CD4+T细胞应答，提示其对结核分枝杆菌具有显著影响。pH值、离子强度及冷冻速率的变化对提升mRNA脂质纳米颗粒的冻干效果至关重要。振动膜雾化器中脂质纳米颗粒的多分散指数从0.1升至0.3，粒径从平均85 nm增至300 nm，表明高剪切应力导致了显著的结构降解。层流流体喷射装置则提升了脂质纳米颗粒的稳定性，进而增强免疫应答并有效抑制有害微生物。

论文主体围绕mRNA-脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）在基因编辑、免疫应答调控及传染病防治中的应用进展展开，涵盖基础机制、制剂开发及临床前研究成果，具体内容如下：

1. 1.
   引言
   蛋白质合成过程将信使RNA（mRNA）转化为相应蛋白质，这一固有机制支撑了疫苗、癌症免疫治疗、蛋白质替代疗法、细胞重编程及基因组编辑等多种生物学与治疗学应用。mRNA疗法可预防并治疗多种疾病，其作用位点为细胞胞质，避免了质粒DNA可能引发的基因组诱变风险。体外转录（IVT）技术简化了mRNA稳定性与免疫原性的调控流程。在药物递送系统中，聚合物、蛋白质-mRNA复合物、脂质基纳米颗粒等生物材料均可用于mRNA运输。SARS-CoV-2的出现推动了全球对疫苗的迫切需求，mRNA疫苗因具备灵活性与快速开发优势成为研究重点，但其需要高效递送至细胞并实现高水平抗原表达，因此脂质纳米颗粒（LNP）的潜力亟待最大化。细胞膜主要成分为脂质，脂质体可作为mRNA及其他载荷的载体。LNP-mRNA疫苗开发的核心挑战之一是mRNA组分稳定性，现有新型疫苗平台普遍依赖冷链存储——传统疫苗可在2°C–8°C冷藏保存6个月，而mRNA-LNP疫苗必须冷冻保存，给基础设施薄弱地区的疫苗分发带来困难。冻干技术通过去除水分可提升疫苗稳定性，以麦芽糖为冻干保护剂的磷酸盐缓冲液（PBS）制备的LNPs经冻干后mRNA包封率低于80%，而5 mM Tris缓冲液可维持其包封效率。创新性连续旋转冻干或批次冷冻干燥工艺已证实可有效冻干含还原敏感性离子izable脂质及20%（w/v）蔗糖的mRNA-LNP制剂，但mRNA疫苗配方与冻干工艺仍需进一步优化。当前mRNA-LNP候选疫苗平台正快速发展以应对多种疾病，但严格遵循精确技术流程至关重要，本综述即聚焦于此方向展开分析。
2. 2.
   LNP-mRNA在基因编辑中的作用
   化学明确的RNA递送载体如LNPs已被广泛研究用于非病毒递送。近期基因组编辑研究表明，LNPs可将Cas9 mRNA与单链向导RNA（sgRNA）递送至小鼠肝脏，通过调整LNP粒径与脂质组成，还可实现向小鼠肝、肺、肌肉及脑部的递送。预存Cas9蛋白免疫原性是该技术的潜在限制因素，而向大面积骨骼肌递送RNA-based CRISPR-Cas9系统的LNP方案因需多次注射、存在免疫反应性、体内安全性风险及注射途径限制尚未验证有效性。非病毒脂质纳米颗粒介导的CRISPR-Cas9基因编辑已在多种癌细胞类型中实现体内80%、体外98%的编辑效率：研究采用小鼠胶质母细胞瘤（GBM）、人浆液性卵巢腺癌Ovcar8（OV8）、NCI-ADR（NAR）、人结肠癌HCT116及人肺腺癌A549细胞系进行验证，以1 μg/mL（总RNA浓度7 nM）sgGFP-cLNPs孵育后，3%–18%的癌细胞出现GFP荧光下降；L8-cLNPs在多种癌细胞系中可实现精准基因编辑且毒性较低，靶向polo样激酶1（PLK1）基因的cLNPs在GBM 005与OV8细胞中分别实现84%与91%的基因组编辑。针对PLK1的CRISPR-LNPs（cLNPs）在单次或多次给药后可抑制肿瘤生长并延长两种侵袭性小鼠癌症模型的生存期：向小鼠GBM模型瘤床单次递送sgPLK1-cLNPs可实现近70%的PLK1基因编辑，激活caspase 3标记，使GBM 005荷瘤小鼠中位生存期延长50%，总生存率提升30%。多数癌症治疗需每日给药，降低患者生活质量并增加毒性与成本，通过CRISPR-Cas9永久性修饰肿瘤存活基因可提升疗效、减少给药频率并突破剂量限制。表皮生长因子受体（EGFR）靶向cLNPs单次注射即可实现80%的PLK1基因修饰，鉴于PLK1调控细胞周期且其在多种恶性肿瘤中表达失调并与预后相关，该策略具有重要价值。在高级别卵巢癌伴恶性腹水小鼠模型中，两次腹腔注射EGFR靶向sgPLK1-cLNPs可抑制肿瘤生长并使生存率超过80%。此外，Cas9核糖核蛋白（RNP）复合物部分分布于LNP外表面，而Cas9 mRNA更易整合至LNP核心；尽管Cas9-RNP整体带负电荷，但其阴离子分布并不均匀。从临床转化角度，近期研究探索了如何利用产前与发育生物学机制克服mRNA-LNP向造血干细胞（HSC）递送的生物屏障，发现胎儿造血与HSC发育所在的肝脏比出生后骨髓微环境更利于LNP介导的基因递送，并在妊娠期间验证了高性能LNP向胎肝递送mRNA-LNP的可行性。动态亚胺硼酸酯键被用于一步三组分合成H₂O₂响应型阳离子可电离类脂，可构建大规模动态共价LNP库并通过高通量筛选优化mRNA递送性能。廉价易获取的化学品被用于快速合成具有更高结构多样性的脂质，末端分支基团脂质可用于解析离子液体结构与功能在LNP递送中的线性与非线性关系，其中支链内体破坏剂（BEND）可电离脂质可提升LNP介导的肝脏蛋白与mRNA转染效率，与Cas9 mRNA及RNP复合物联用时可增强T细胞转染与肝脏基因编辑效果。
3. 3.
   mRNA-LNP在诱导免疫应答中的作用
   脂质纳米颗粒制剂通常包含可电离脂质、辅助脂质、胆固醇及聚乙二醇化脂质，多数研究聚焦于可电离脂质在RNA包封与内体逃逸中的作用。MC3 DOPE配方在THP-1细胞中诱导的细胞因子水平高于C12–200 DOPE，1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE）配方因增加LNP摄取而提升THP-1细胞因子产生，其作为辅助脂质的融合特性可促进货物转运，在相同剂量下提升表达水平与细胞因子产量。病毒蛋白酶切割位点（VPCS）疫苗是首个能够诱导靶向VPCS的窄谱免疫应答的HIV疫苗策略，其应答特征与HIV高暴露未感染人群（HESNs）相似，MEVPCS-mRNA脂质纳米颗粒可通过CD8⁺T细胞介导的特异性免疫应答抑制HIV感染，疫苗诱导的抗原特异性CD8⁺中央记忆T细胞可被MEVPCS-mRNA LNPs增强，来自MEVPCS多肽单元的表位可模拟HLA I类等位基因表位，在小鼠模型中触发MHC-I限制性CD8⁺T细胞免疫应答。近期研究显示，由阳离子脂质（ALC0307）、胆固醇、磷脂酰胆碱及聚乙二醇脂质（APCP）包裹的核苷修饰mRNA可在皮内与肌内注射后诱导显著的表位特异性CD8 T细胞应答并形成记忆细胞，该过程依赖I型干扰素受体（IFN-I，又称IFNAR）。皮下递送包裹于1,2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷（DOTAP）/DOPE中的mRNA疫苗可能需要抑制I型干扰素（IFN-I）信号以激活CD8 T细胞应答，其必要性正在评估中，mRNA-LNP疫苗在具备功能性IFN-I应答患者中刺激CD8 T细胞应答的效果可能取决于LNP的组成。近期临床研究已证实mRNA-LNP疫苗的有效性，但治疗性HIV疫苗研究明显不足，预防性mRNA HIV疫苗已取得显著进展——预防性免疫应答以HIV包膜特异性中和抗体为核心，而治疗性免疫则需强烈的Gag特异性多功能CD8⁺T细胞应答。肠淋巴组织虽至关重要，但在临床前与分析研究中常被忽视，目前针对小鼠或猕猴中Gag特异性多功能CD8⁺T细胞应答的mRNA-LNP配方研究十分有限。mRNA-LNP疫苗可同时诱导体液（抗体）与细胞介导（T细胞）保护，LNP可通过增加抗原摄取与促进内体逃逸增强抗原特异性细胞免疫应答。CpG寡脱氧核苷酸（CpG ODNs）可分为A（D）、B（K）与C型，全硫代磷酸酯CpG-B ODN CPG 1018含至少一个CpG二核苷酸，虽可刺激B细胞并增强TLR9依赖性NF-κB活化，但诱导IFN-α产生的能力有限；CpG 2395属于C类，兼具A类与B类特性，可促使浆细胞样树突状细胞（pDC）产生IFN-α并激活B细胞。在小鼠中，包裹CpG 1018的LNP在狂犬病病毒（RABV）保护与体液及细胞免疫应答方面均优于游离CpG 2395。SP-HBsAg mRNA-LNP疫苗在小鼠模型中通过诱导强烈的抗原特异性Th1细胞偏向性免疫应答增强了对乙型肝炎病毒（HBV）感染的保护力，两种mRNA疫苗候选物均可降低慢性感染小鼠的血清乙型肝炎表面抗原（HBsAg）浓度，慢性乙型肝炎（CHB）小鼠接种后CD8⁺T细胞介导的应答最强且血浆HBsAg水平最低。在血液系统恶性肿瘤中，自然杀伤（NK）细胞疗法获益最显著，但实体瘤治疗仍面临巨大挑战——肿瘤微环境（TME）中恶性细胞释放的细胞因子会抑制NK细胞募集与功能，转化生长因子β（TGFβ）可降低NK细胞代谢、细胞因子活性及脱颗粒能力，而mRNA疗法提供了潜在解决方案。NK细胞转染难度大且受限，近期研究显示LNP转染效率较电穿孔高75%（分别为99.5%与57%的细胞活力），LNP转染的几何平均荧光强度（gMFI）较电穿孔提升5倍，增强型绿色荧光蛋白（eGFP）表达显著上调，荧光显微镜观察也证实LNP在信号强度与蛋白水平方面均优于电穿孔。
4. 4.
   mRNA-LNP制剂在传染病中的应用
   mRNA-LNP在传染病防治中发挥重要作用，其增强免疫应答的效果优于mRNA直接应用。编码CysVac2蛋白的LNP-mRNA疫苗mRNACV2在小鼠中显示出良好效力，CysVac2由慢性感染中的免疫显性抗原Ag85B与硫吸收途径过表达蛋白CysD融合而成。接种mRNACV2的小鼠针对结核分枝杆菌（MTB）气溶胶感染的防护作用与疫苗特异性多功能CD4⁺T细胞数量增加相关，该类细胞可共分泌IFNγ、IL-2与TNF。动物模型中多功能CD4⁺T细胞可提供MTB防护，但人类中未必如此，且CysVac2佐剂疫苗诱导的细胞因子产生CD4⁺T细胞与抗原特异性Ag85B:I-Ab⁺T细胞数量高于其他研究报道，接种LNP-mRNA的小鼠表现出强烈的Th1型CD4⁺T细胞应答。针对金黄色葡萄球菌（S. aureus）感染，研究评估了三种单克隆抗体（mAbs）在mRNA/LNP系统中的药代动力学与功能活性，采用单链可变片段-可结晶片段（ScFv-Fc）与免疫球蛋白G（IgG）形式以避免重链与轻链错配，给药24小时后scFv-Fc与IgG形式的C_max分别为10–22 μg/mL与15–90 μg/mL，两者均有效，三联mAb可保护小鼠免受S. aureus诱导的皮肤坏死。非人灵长类动物（NHPs）经mRNA递送三联IgG后血药浓度达2.9–13.7 μg/mL，终末半衰期为11.8–15.4天。该研究最初联合靶向表面表达的聚集因子A（ClfA）、四种双组分杀白细胞毒素（LukSF、LukED、HlgAB、HlgCB）及α毒素（AT）的三联mAb以应对革兰阳性菌S. aureus。mRNA-LNP GAS疫苗模块Combo#5包含五种高度保守且具有保护性的解毒化脓性链球菌（GAS）抗原：触发因子（TF）、精氨酸脱亚胺酶（ADI）、链球菌C5a肽酶（SCPA）、链球菌溶血素O（SLO）、IL-8及蛋白酶，研究分析了Combo#5-TM mRNA-LNP对小鼠体液与细胞免疫应答的影响，重点关注CD4⁺与CD8⁺T细胞应答、生发中心B细胞及记忆B细胞（均为持续抗体应答的关键）。Combo#5-TM疫苗可增加滤泡辅助T（Tfh）细胞数量，而Tfh细胞对GC B细胞增殖与抗体产生至关重要，表明该疫苗可同时增强GAS感染所需的体液与细胞免疫应答。针对慢性HBV感染，从急性HBV供体骨髓中分离的LNP递送mRNA可通过核心抗原特异性T细胞实现病情缓解，与传统疗法复发不同，HBV康复者核心与聚合酶特异性应答更强且维持病毒学控制。腺相关病毒（AAV）-HBV小鼠经多抗原疫苗接种后，核心特异性CD4⁺与CD8⁺应答较初始动物显著降低，调整疫苗抗原比例可增强核心特异性应答。肌内注射后LNP将mRNA递送至肌细胞或引流淋巴结中的树突状细胞等抗原呈递细胞，可增强免疫应答与疫苗接种效果。针对流感病毒，近期研究评估了mRNA-LNP对系统性与黏膜免疫的诱导作用，靶向Aic HA抗原的系统发育2型流感变异株可引发广泛交叉反应的细胞免疫，降低并预防流感感染，所有疫苗接种组（包括单剂PHC）在体外抗原再刺激后脾脏T细胞的CD127表达均较初始组显著降低。呼吸道合胞病毒（RSV）研究中，鼻内接种LNP配方的SMARRT.RSV.preF可使RSV致敏小鼠鼻腔部位IgA抗体升高，而大多数初始动物无应答；恢复期与初始患者对mRNA/自我扩增RNA（saRNA）疫苗的黏膜IgA应答可能存在差异，这源于病毒感染或初次免疫后的预存B细胞经循环抗原或细胞迁移被增强。HIV特异性潜伏期逆转药物可减少潜伏HIV储存库并辅助抗逆转录病毒病毒学控制，LNP X与表达HIV Tat前72个氨基酸第一个编码外显子的mRNA联用时，可克服所有HIV转录起始与RNA加工障碍，超越常规T细胞丝裂原诱导的病毒再激活，且新型Tat-LNP X逆转HIV潜伏期的效果更优，但因未披露LNP配方且实验中使用的Tat66亚型生物学特性未知，无法直接比较两种Tat-LNPs，Tat-LNP X的优越性可能源于其高效的mRNA转运能力（与其低转染效率相兼容）。
5. 5.
   mRNA-LNP配方与应用的相关因素
   mRNA-LNP的药物开发与诊断研究需依托优化配方，整合理化特性以获取精确结果。近期研究显示，含10%（w/v）蔗糖的PBS配制的LNP-RNA疫苗在?20°C下可良好保持物理与功能完整性至少30天，该温度支持冷链疫苗分发，Moderna COVID-19疫苗（mRNA-1273）即采用此条件。在LNP-RNA系统中，?20°C可提供最佳冰成核、渐进冷却及颗粒结构保护，同时防止RNA水解断裂。多项研究已证实mRNA LNPs可冻干，但影响冷冻干燥的参数尚未系统研究，优化冻干工艺需纳入冷冻速率、离子强度与pH波动等因素。针对mpox疫苗候选物的mRNA-LNP配方，含蔗糖与海藻糖或麦芽糖不同比例的十种配方中，玻璃化转变温度（Tg’）与塌陷温度（Tc）分别在?31.8°C至?34.1°C与?27.0°C至?32.0°C范围内，初始冻干参数（每批20瓶）设定为冷冻温度低于Tg’、初级干燥温度低于Tc；无冻干保护剂的mRNA-LNP（C0）冻干后在瓶底残留少量白色粉末，复溶后出现不透明外观与大量可见不溶颗粒。研究通过偏好函数最大化特定条件下的合意性以筛选最优LNP配方，目标包括RNA完整性>50%、粒径<100 nm、多分散指数（PDI）<0.2、包封率（EE）>80%及最大化蛋白表达——其中合意性函数1降低免疫原性，函数2提升免疫原性，函数3独立于体外评估优化RNA完整性。震荡混合也是LNP配方的关键环节，随震荡时间延长，LNP粒径在前2小时急剧增大，2–4小时增速放缓并趋于稳定；PDI在前2–4小时急剧上升后下降；NanoFlowSizer检测显示震荡使LNP粒径分布从窄单峰变为宽单峰的双峰分布，低mRNA浓度配方更易在稀释或样品处理过程中截留空气，这可能是震荡导致粒径与PDI波动的原因。LNP配方中的脂质可分为阳离子或可电离脂质、两性离子磷脂、中性辅助脂质、胆固醇及聚乙二醇化脂质，可通过反相（RP）高效液相色谱（HPLC）分离与定量，但多数脂质（包括磷脂）缺乏发色团，需替代紫外检测手段。质谱（MS）虽具备优异选择性与灵敏度，但成本高、维护要求严苛且需专业人员操作，不适用于质量控制，而带电气溶胶检测器（CAD）与蒸发光散射检测器可通过雾化与蒸发流动相检测挥发性低于流动相的物质，不受折射率限制。近期研究采用hEPO mRNA评估合成的HEPES脂质的体内效力，单次肌注后小鼠模型显示Gen1 HEPES脂质产生的hEPO蛋白量与行业标准SM-102和MC3相当，且高于Gen2脂质，Gen2尾部酯基可能加速体内脂质降解。尺寸排阻色谱（SEC）结合多角度光散射（MALS）检测器与浓度检测器（如示差折光仪dRI与紫外光度计）可有效表征LNP，SEC-MALS-UV-dRI无需参考标准即可评估SEC峰的样品浓度与粒径，当已知二元缀合物的紫外消光系数与dn/dc值（或特定折射率增量）时，多检测器系统可即时测定洗脱馏分中的两种组分。CM雾化器（振动膜）会导致LNP粒径从平均85 nm增至300 nm，PDI从0.1升至0.3，表明高剪切应力造成显著结构损伤；而层流流体喷射（LFE）装置的LNP稳定性更优，粒径一致且PDI变化极小（mRNA为0.099，saRNA为0.117）。LNP-mRNA粒径与mRNA包封率是影响体外效力的关键质量属性，建议结合基于不同测量原理的正交程序验证复杂质量属性，符合FDA与ICH Q2R2指导原则对LNP-mRNA配方的要求。除纳米材料与脂质体外，分析超速离心（AUC）也可用于测定大分子粒径，沉降速度分离颗粒时，沉降系数分布依赖于样品中各颗粒群的质量、密度与形状。
6. 6.
   讨论
   本综述分析了基于mRNA-LNP的药物模块在基因编辑改进、免疫应答增强及对抗多种传染病与恶性肿瘤活性方面的进展。多项研究已阐明LNP的作用机制，关键因素关联准确性、灵敏度与稳定性。LNPs可通过与抗原呈递细胞（APCs）上的模式识别受体（PRRs，包括Toll样受体TLRs）相互作用激活免疫系统，LNP与PRRs的互作还会诱导TNF-α等促炎细胞因子释放，提示先天免疫应答被激活。在增强呼吸道mRNA-LNP制剂方面，近期研究显示含mRNA/LNP的黏膜黏附薄膜作为加强针诱导的抗体滴度与标准肌内疫苗相当，且可产生局部IgA滴度，潜在提升对呼吸道感染的免疫防护；但mRNA-LNP吸入疗法目前受限于雾化过程中的剪切力与肺黏液屏障，通过肺表面活性脂质修饰纳米颗粒可增强其穿透肺屏障的能力并减少肺组织清除。在LNPs中封装编码蛋白佐剂的mRNA而非抗原，可提升现有疫苗的免疫原性，但开发能同时增强T细胞介导的细胞免疫与体液应答的保护性疫苗仍具挑战性。LNP包裹的mRNA可增强多种病毒感染的免疫应答，经修饰以逃避免疫系统的T细胞可通过脂质纳米颗粒递送以提升疫苗效力。LNP携带mRNA进入抗原呈递细胞是mRNA疫苗开发的核心挑战，目前已测试多种高包封率的可电离脂质配方用于不同mRNA疫苗，因此LNP组分的选择至关重要。稳定性数据显示，LNP-Luc制剂在4°C下冷冻保存至少7天仍保持稳定，含12% Tris-蔗糖的冷冻保护缓冲液可维持LNP-Luc的物理性质与mRNA转运效率，与新配方表现一致。Alameh等指出LNP配方可作为重组蛋白疫苗的佐剂，推动高效下一代蛋白基疫苗开发，且研究显示RIG-I/MDA5与多数TLRs无法识别LNP；MyD88与MAVS缺陷小鼠对rHA+eLNP免疫的Tfh与GC B细胞应答基本不变，未来研究将探索LNP识别与IL-6调控机制，MyD88缺陷小鼠对mRNA-LNP疫苗的Tfh与GC B细胞刺激减弱。类似COVID-19疫苗，1-甲基假尿苷修饰的mRNA疫苗可增强蛋白翻译并减少PAMP感应触发的炎症。创新核酸药物靶向遗传与转录组紊乱，mRNA与siRNA被用于调控细胞内蛋白水平——siRNA进入胞质后激活RNA干扰（RNAi）通路沉默转录后基因，mRNA可诱导治疗性蛋白与抗原的合成。体内RNA治疗面临核酸酶降解、组织分布与膜转运的挑战，因此需将其包裹于合成纳米颗粒中。目前纳米颗粒与转录组学研究前景广阔，其中LNPs是RNA递送效率最高的载体之一，且基于LNPs的基因编辑是恶性肿瘤与传染病治疗的近期重要进展。
7. 7.
   结论
   本研究评估了mRNA-LNP在CRISPR-Cas9基因编辑中的效能，旨在提升临床与诊断研究的结果。基于LNP的药物递送聚焦于多种传染病的治疗，并强调了与mRNA-LNP配方相关的、可增强此类疾病免疫应答的因素。现有研究与发现正逐步填补mRNA-LNP领域的知识空白。