《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》：Cardiomyocyte-targeted Gi signaling promotes cardiac repair under sustained adrenergic stress in mice
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马科斯·埃利泽克（Marcos Eliezeck）|塞尔吉奥·里卡多·阿卢奥托·斯卡尔佐·朱尼奥尔（Sérgio Ricardo Aluotto Scalzo Júnior）|马特乌斯·查韦斯·达科斯塔（Mateus Chaves da Costa）|维克托·莫拉（Victor
马科斯·埃利泽克（Marcos Eliezeck）|塞尔吉奥·里卡多·阿卢奥托·斯卡尔佐·朱尼奥尔（Sérgio Ricardo Aluotto Scalzo Júnior）|马特乌斯·查韦斯·达科斯塔（Mateus Chaves da Costa）|维克托·莫拉（Victor Moura）|泰丝·马奎斯·达席尔瓦（Thais Marques da Silva）|卡洛斯·阿尔贝托·阿吉亚尔·席尔瓦（Carlos Alberto Aguiar Silva）|弗拉维亚·L·马丁斯（Flavia L. Martins）|西贝莱·罗查-雷森德（Cibele Rocha-Resende）|鲁本斯·法赞（Rubens Fazan）|埃利奥·塞萨尔·萨尔加多（Hélio César Salgado）|瓦尼亚·F·普拉多（Vania F. Prado）|阿德里亚娜·C·吉拉尔迪（Adriana C. Girardi）|马科·安东尼奥·马克西莫·普拉多（Marco Ant?nio Máximo Prado）|西尔维娅·瓜蒂莫西姆（Silvia Guatimosim）
巴西米纳斯吉拉斯联邦大学（Universidade Federal de Minas Gerais）生物科学研究所（Institute of Biological Sciences）生理学与生物物理学系（Department of Physiology and Biophysics），贝洛奥里藏特（Belo Horizonte），米纳斯吉拉斯州（Minas Gerais）
摘要
增强胆碱能信号传导与心脏保护相关，其中通过M2型毒蕈碱受体激活心肌细胞中的Gi通路被认为是其中的一个机制。为了验证这一治疗策略，我们利用DREADD技术改造了Myh6-Cre/hM4Di小鼠，使其在心肌细胞中选择性激活Gi信号传导（CM-Gi+）。通过给予氯氮平-N-氧化物（CNO）来控制Gi通路的激活时间，并在肾上腺素诱导的心肌病模型中评估其效果。体外实验表明，CNO可抑制Myh6-Cre/hM4Di心肌细胞的收缩，并减弱异丙肾上腺素（ISO）引起的收缩增强及PKA靶点的磷酸化，这与Gi通路激活一致。体内实验中，7天的ISO处理导致了心脏肥大、炎症和纤维化标志物的表达，而这些现象均被CNO驱动的CM-Gi+信号传导所抑制。该干预措施还保护了心肌细胞在ISO刺激下的存活能力，进一步证实了其细胞保护作用。为了评估这种细胞靶向方法在损伤更严重阶段的疗效，我们在ISO处理第4天开始CNO治疗，此时细胞死亡和炎症现象较为明显。超声心动图、组织学和流式细胞术分析显示，延迟的CM-Gi+激活恢复了心脏功能并阻止了巨噬细胞的积聚。收缩力评估证实ISO处理后的小鼠心肌细胞功能恢复正常，支持了心肌细胞恢复的概念。从机制上看，这些有益效果与CCR2+单核细胞在心脏中的浸润减少有关，而CCR2+单核细胞是不良重塑的主要驱动因素。我们的发现表明，心肌细胞特异性Gi通路激活是一种细胞保护策略，可在持续肾上腺素刺激下促进心肌修复。这项工作为精准细胞靶向疗法奠定了基础，旨在调节受损心脏中的胆碱能/Gi信号传导。
引言
心脏自主神经失衡是心脏经历应激事件后的主要病理变化之一[1]。这种失衡表现为交感神经张力增加，作为调节心率（HR）和收缩力等心脏参数的补偿机制，旨在改善心输出量[2]。治疗策略通常侧重于β-肾上腺素受体阻断[3]；然而，替代或补充方法是否具有心脏保护作用仍不明确。
实验和临床研究表明，胆碱能激活作为对抗交感神经过度激活的调节机制具有心脏保护作用。例如，与心率同步的迷走神经刺激已被证明可改善心力衰竭患者的生活质量[4]。此外，先前的报告指出，接受抗胆碱酯酶药物治疗的阿尔茨海默病患者的心血管事件发生率低于未接受这些治疗的患者[5]、[6]。在此背景下，我们团队及其他团队的临床前研究表明，无论是通过药物还是迷走神经刺激增强胆碱能张力，都能减轻多种实验模型中的心脏功能障碍[7]、[8]、[9]、[10]、[11]。此外，利用基因工程改造的胆碱能增强小鼠模型，我们的团队发现其能抵抗血管紧张素II（Ang II）引起的心脏重塑[12]。
尽管证据不断积累，但乙酰胆碱（ACh）介导的心脏保护的细胞机制仍不明确。我们[13]、[14]及其他研究者[15]发现，心肌细胞分泌ACh是一种局部机制，可放大心脏神经的胆碱能信号传导并保护心脏功能[10]。ACh激活的主要下游通路之一是Gi信号通路，该通路由M2型毒蕈碱受体（M2-AChR）介导，这类受体在心房、心室和起搏细胞的功能中起关键作用[16]。在各种疾病状态下，Gi2亚型的表达和信号传导增强[17]。然而，Gi信号通路在心脏疾病进展中的作用仍存在争议。虽然选择性抑制心肌细胞（CMs）中的Gi通路会加剧缺血损伤后的细胞死亡[18]，但其在心脏中的条件性表达与致命性心肌病、收缩功能障碍和左心室扩张有关[19]。为了解决这些矛盾现象并阐明心肌细胞特异性Gi通路激活在减轻肾上腺素过度刺激引起的广泛损伤中的作用，我们采用了DREADD技术。我们创建了Myh6-Cre/hM4Di小鼠，其中抑制性受体hM4Di仅在心肌细胞中选择性表达，从而在给予氯氮平-N-氧化物（CNO）时实现精确、时间可控的Gi信号传导。这种方法使我们能够避免长期、不受控制的Gi通路激活带来的有害影响[19]。结果表明，心肌细胞中的靶向Gi通路激活可阻止持续肾上腺素刺激引起的心脏损伤，为新型细胞靶向治疗策略提供了依据。
章节片段
性别作为生物学变量
我们的研究涵盖了雄性和雌性动物，两种性别的结果相似。
动物
R26-LSL-hM4Di-DREADD小鼠由布莱恩·罗斯（Bryan Roth，北卡罗来纳大学）和乌特·霍赫格申德（Ute Hochgeschwender，中央密歇根大学）慷慨提供。这些小鼠与Myh6-Cre小鼠（JAX品系，RRID: IMSR_JAX:011038）杂交，生成了Myh6-Cre/hM4Di小鼠（图1A），从而在心肌细胞中选择性表达hM4Di（一种人类M4型毒蕈碱受体）。hM4Di受体对CNO有反应，但对ACh或其他物质无反应
Myh6-Cre/hM4Di模型的特征
为确认hM4Di在心肌细胞中的选择性表达，我们检测了Myh6-Cre/hM4Di小鼠的心脏组织中的mCitrine荧光蛋白，该蛋白是重组成功的标志。如补充图1所示，mCitrine荧光仅存在于心肌细胞中，而冠状血管和心脏切片中的细胞外基质细胞中未检测到该蛋白。相比之下，hM4Di或Myh6-Cre对照组小鼠的组织中未检测到mCitrine荧光
讨论
我们的研究加深了对心肌细胞特异性Gi通路作为胆碱能心脏保护和心肌修复核心机制的理解，为在持续交感神经刺激下调节胆碱能/Gi通路的精准细胞靶向干预奠定了基础。这种靶向策略不仅中断了不良的心脏重塑，还逆转了其进程。该策略的核心特点是提供了细胞保护作用
研究局限性
本研究存在一些局限性。首先，我们未测量接受ISO或ISO+CNO处理的Myh6-Cre/hM4Di小鼠的心率。虽然缺乏这些数据限制了我们全面评估CM-Gi+激活在肾上腺素刺激下的变时效应的能力，但心电图记录表明CNO可能有助于恢复被肾上腺素过度激活破坏的自主神经平衡。其次，尽管肾上腺素过载模型提供了有价值的机制见解，但它并不能完全
CRediT作者贡献声明
马科斯·埃利泽克（Marcos Eliezeck）：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、数据可视化、验证、监督、软件使用、资源管理、项目协调、方法学设计、研究实施、资金申请、数据分析、概念构思。塞尔吉奥·里卡多·阿卢奥托·斯卡尔佐·朱尼奥尔（Sérgio Ricardo Aluotto Scalzo Júnior）：撰写 – 审稿与编辑、软件使用、方法学设计、研究实施、数据分析。马特乌斯·查韦斯·达科斯塔（Mateus Chaves da Costa）：撰写 –
关于写作过程中使用生成式AI和AI辅助技术的声明
作者在撰写本文过程中未使用生成式AI或AI辅助技术。
资助
本研究得到了以下机构的资助：
米纳斯吉拉斯州研究基金会（Funda??o de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais）（FAPEMIG）：RED-00081-23、RED-00202-22、Ciência por elas Fapemig-APQ-04203-23、APQ-01154-23、APQ-05838-23、APQ-02501-25；塞拉皮莱拉研究所（Serrapilheira Institute）（R-2211-42259）；FAPESP 2021/14534–3、INCT纳米生物制药（INCT Nano-Biofarmacêutica）；利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。
