肥厚型心肌病小鼠模型中脂肪酸和丙酮酸氧化的突变特异性损伤

《Journal of Molecular and Cellular Cardiology》：Mutation specific impairment of fatty acid and pyruvate oxidation in hypertrophic cardiomyopathy mouse models

　　

Mukundan Ragavan | Garretty Knotts | Tilo Thottakara | Anthony G. Giacalone | Hannah Eades | Peder Larson | M. Roselle Abraham | Matthew E. Merritt

美国田纳西州孟菲斯市圣裘德儿童研究医院结构生物学系，邮编38105

摘要

背景与假设

肥厚型心肌病（HCM）被认为是一种代谢性疾病，但目前尚不清楚所有肌节蛋白基因突变是否都会导致心脏能量代谢的类似紊乱。我们之前的研究显示小鼠模型中的线粒体功能存在差异，这使我们假设HCM突变会导致特定等位基因的代谢途径重塑。为了验证这一假设，我们采用三重示踪方法检测了R403Q-MyHC和R92W-TnT突变心脏在疾病进展阶段对脂肪酸（FA）、酮体和葡萄糖氧化的利用情况。

方法

将14–16周大的小鼠心脏进行Langendorff灌流，达到稳态¹³C富集（约30分钟），然后置于14.1℃的NMR仪中进行³¹P光谱分析。灌流液中包含多种底物，这些底物可产生不同标记的乙酰辅酶A：[1,6-¹³C₂]葡萄糖、[U¹³C]混合脂肪酸和[1,3-¹³C₂]β-羟基丁酸。灌流结束后，心脏被冷冻固定并提取用于¹³C NMR同位素分析。使用Clark电极测量灌流液中的氧浓度，从而计算心肌耗氧率（MVO₂）。

结果

根据将MVO₂与还原当量生成相对应的柠檬酸循环（CAC）代谢模型，我们观察到MyHC突变体的脂肪酸（FA）氧化和丙酮酸脱氢酶（PDH）通量显著降低，而TnT突变体的底物利用情况与对照组相似。³¹P光谱分析显示MyHC突变体的能量储备显著减少，表现为PCr/ATP比率降低，而TnT突变体的PCr/ATP比率与对照组相当。

结论

心脏代谢通量测量结果显示R403Q-MyHC突变体存在能量缺陷，而R92W-TnT突变体则没有，这反映了心脏能量代谢的等位基因特异性重塑。这些结果表明，针对脂肪酸或碳水化合物代谢下调的治疗手段可能具有针对特定突变的效果。

引言

肥厚型心肌病（HCM）是最常见的遗传性心肌病，最近报告的患病率为约1:500，全球患病人数预计约为2000万。大约50–60%的HCM患者具有可识别的肌节蛋白基因突变，这些突变导致心肌细胞肥大、纤维化和小动脉重塑。无论是基因型阳性还是阴性的HCM心脏，一个共同特征是肌节收缩效率低下，从而导致ATP消耗增加[2]和能量不足[3]，这使人们认为HCM是一种代谢性疾病[4]。

心脏是一种“代谢杂食者”，可以利用多种底物（脂肪酸、酮体、氨基酸、碳水化合物如葡萄糖/乳酸）来生成ATP，但主要依赖脂肪酸（FA）氧化和葡萄糖氧化[5]。磷-31 NMR研究表明，R403Q-MyHC[6]和R92W-TnT[7]突变小鼠在受到正性肌力负荷时ATP需求增加，导致ATP储备减少。HCM患者的研究也证实了能量不足和代谢重塑的存在[8]、[9]、[10]、[11]，这些研究显示心肌磷酸肌酸（CrP）水平降低、CrP/ATP比率下降[8]、[9]、肌酸激酶通量减少[12]以及心脏代谢组异常[13]、[14]、[15]。然而，HCM心脏能量不足背后的底物利用变化尚未明确[16]。

长链脂肪酸的完全氧化产生的ATP量高于葡萄糖氧化，但作为能量底物时，葡萄糖比脂肪酸更节省氧气[17]。基于这一原理，我们研究了perhexiline（一种肉碱棕榈酰转移酶I（CPT-I）抑制剂）在HCM小鼠模型和患者中的作用[18]、[19]。关于能量供应的底物选择及其与HCM表型关系的关键问题仍未解决。为了解决这些问题，我们采用三重示踪方法[20]，在疾病进展阶段体外检测了R403Q-MyHC和R92W-TnT突变体及其同窝对照小鼠心脏对葡萄糖、脂肪酸和酮体的利用情况。我们发现MyHC突变体的脂肪酸氧化、丙酮酸脱氢酶（PDH）通量和PCr/ATP比率显著降低，表明其心脏能量不足，而TnT突变体的CAC通量仅略有下降。

章节摘录

实验动物

表达R403Q突变的C57Bl/6雄性小鼠（来自Leinwand博士）[21]或R92W突变的C57Bl/6 N雌性小鼠（来自Tardiff博士）[23]、[24]、[25]（Charles River公司）进行了杂交。小鼠在4周大时通过PCR进行基因分型。所有实验均在14–16周大的雄性小鼠中进行，这一年龄对应于疾病进展阶段[21]、[22]、[26]。根据心脏提取后的重量和体重

小鼠生理表型分析

MyHC突变体的心脏体积较大（图1B），其心脏重量与体重比率高于对照组（图1C）。超声心动图显示MyHC突变体的左心室质量较高，TnT突变体的双心房扩大也较明显（图1B、D-E）。TnT突变体的心肌收缩力分数较高（与对照组相比），而MyHC突变体与对照组相似（图1F）。综合来看，我们的数据表明

讨论

我们的研究设计有助于全面评估两种遗传学上不同的HCM模型中乙酰辅酶A生成的底物选择情况。这两种模型涵盖了人类疾病的两种极端情况：即幼年猝死（R92W-TnT）[36]和中年需要移植的心力衰竭（R403Q-MyHC）[38]。我们发现MyHC突变小鼠的心脏能量不足是由CAC通量减少引起的，而TnT突变小鼠则没有这种现象。

人工智能披露

本手稿的任何部分均未使用生成式人工智能。

CRediT作者贡献声明

Mukundan Ragavan：正式分析、数据管理、概念构思。Garretty Knotts：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、正式分析。Tilo Thottakara：正式分析、数据管理。Anthony G. Giacalone：正式分析、数据管理。Hannah Eades：正式分析、数据管理。Peder Larson：撰写——初稿撰写、概念构思。M. Roselle Abraham：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、资金筹集、概念构思。Matthew E. Merritt：

致谢

本研究的部分工作在国家高磁场实验室的McKnight脑研究所进行，该研究所配备了先进的磁共振成像和光谱（AMRIS）设施，该设施得到了国家科学基金会合作协议（DMR-2128556）和佛罗里达州政府的支持。部分工作使用了由NIH资助开发的1.5毫米高温超导低温探针（R01 EB009772）。MEM感谢NIH（RM1-GM148766、R01-DK132254）的支持。