《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：EGFR Tyrosine Kinase Inactivation by Withacoagulin-Induced Conformational Shift
编辑推荐：
Smita Manjari Panda | Umakanta Tripathy
印度理工学院（印度矿业学院）物理系，丹巴德，丹巴德-826004，贾坎德邦，印度
摘要
表皮生长因子受体（EGFR）是一种跨膜蛋白，在调节细胞增殖、存活、分化和迁移等过程中起着至关重要的作用。EG
Smita Manjari Panda | Umakanta Tripathy
印度理工学院（印度矿业学院）物理系，丹巴德，丹巴德-826004，贾坎德邦，印度
摘要
表皮生长因子受体（EGFR）是一种跨膜蛋白，在调节细胞增殖、存活、分化和迁移等过程中起着至关重要的作用。EGFR的过度表达与许多恶性肿瘤相关，因此成为开发抗癌药物的理想靶点。来自药用植物的天然分子为治疗癌症等危及生命的疾病提供了有吸引力的选择。鉴于此，本研究的主要目的是寻找能够抑制EGFR酪氨酸激酶（EGFR TK）的强大植物成分。我们建立了一个包含2000种此类植物成分的数据库，并将其与标准药物吉非替尼进行了比较。共有215种分子的对接得分高于截止值-7.4 kcal/mol（吉非替尼的对接得分）。通过ADMET和结合分析，我们发现M31（Withacoagulin）、M39（LTS0153006）和M40（Somniferanolide）是最有前景的候选物，它们具有适宜的药物特性，并且能与EGFR TK发生良好的相互作用。与表现出肝毒性的标准药物不同，这些化合物预计不会具有肝毒性。此外，分子动力学（MD）模拟和结合自由能计算表明，Withacoagulin与EGFR TK的结合更为牢固，能够使蛋白质更倾向于其非活性状态。因此，它可以作为治疗EGFR过度表达相关癌症的潜在药物。
引言
癌症是全球第二大死亡原因，2020年估计有1000万人因此丧生，约占所有死亡人数的六分之一。男性中最常见的癌症类型是肺癌、前列腺癌、结直肠癌、胃癌和肝癌，而女性中最常见的则是乳腺癌、结直肠癌、肺癌、宫颈癌和甲状腺癌[1]。与癌症发展密切相关的关键因素之一是表皮生长因子受体（EGFR）的异常活性[2]。表皮生长因子受体（EGFR，也称为ErbB1、Her1）是一种由1210个氨基酸组成的跨膜受体酪氨酸激酶，属于ErbB/HER家族，负责传递对细胞增殖、分化和运动至关重要的信号[3]。EGFR包含一个细胞外域、一个跨膜域以及一个细胞质酪氨酸激酶域和羧基末端信号域[4]、[5]。当生长因子结合时，EGFR和其他ErbB家族成员会形成同源或异源二聚体，激活其细胞质酪氨酸激酶域以启动细胞内信号传导[2]。EGFR酪氨酸激酶域（EGFR TK）包含许多调节其活性的关键结构元素[6]。它由两个主要部分组成：N-叶（N端叶）和C-叶（C端叶）[7]。N-叶主要由β-折叠片组成，并包含αC-螺旋（753-767 AA），在激酶调节中起关键作用。它通常有两种构象：一种是激酶活性持续的活性状态，另一种是非活性状态[8]、[9]。图1展示了带有结构元素αC-螺旋（753-767 AA）、DFG（855-857 AA）和激活环（855-876 AA）的EGFR TK域的结构[10]、[11]。在活性状态下，αC-螺旋采用“αC-in”构象，通过K745-E762残基形成的盐桥得以稳定[12]。而在非活性状态下，αC-螺旋移至“αC-out”位置，破坏了盐桥，阻碍了激酶活性所需的正确对齐。任何干扰这种蛋白质正常过程的因素都会导致EGFR TK过度激活，进而使正常细胞发生癌变。这使得EGFR TK成为癌症药物治疗中最重要的靶点之一[13]。
此外，EGFR的过度表达和突变激活与多种人类恶性肿瘤有关，包括非小细胞肺癌（NSCLC）、胶质母细胞瘤（脑或脊髓癌）、乳腺癌、口腔癌、卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、前列腺癌和头颈部癌症[14]、[15]。40-89%的NSCLC病例中EGFR过度表达[4]。在乳腺癌中，尤其是三阴性乳腺癌（TNBC）中，EGFR也显著表达[16]。因此，研究人员将EGFR TK视为癌症治疗的主要靶点[17]。基于靶点的治疗方法，如使用酪氨酸激酶抑制剂来干扰肿瘤生长信号，以及其他策略如激素治疗、免疫治疗、放射治疗、化疗和手术，都显得尤为重要。目前已有几种EGFR酪氨酸激酶抑制剂（如吉非替尼、厄洛替尼、拉帕替尼等）获得FDA批准并在临床使用[2]。尽管这些抑制剂显示出临床效果，但后来发现它们会伴随多种严重的不良反应，包括肝毒性、腹泻、痤疮样皮疹、黏膜炎和肝酶水平升高（如丙氨酸氨基转移酶（ALT）[18]、[19]、[20]、[21]。在某些情况下，使用EGFR TKIs治疗时还报告了更严重的并发症，如间质性肺病和其他系统毒性[22]。Yin等人的荟萃分析显示，接受EGFR-TKIs治疗的患者中最常见的所有级别不良反应（AEs）是腹泻（53.7%）、皮疹（48.6%）、黏膜炎（46.5%）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）升高（38.9%）和皮肤反应（35.2%）。最常见的高级别（≥3级）AEs包括黏膜炎（14.8%）、疼痛（8.2%）、代谢和营养障碍（7.4%）、腹泻（6.2%）和呼吸困难（6.1%）。由于AEs导致的严重AEs发生率、治疗中断和死亡比例分别为18.2%、12.36%和3.0%[18]。此外，目前的EGFR抑制剂尚未对乳腺癌患者显示出显著的临床益处[16]。鉴于药物耐药性的增加以及抗癌药物相关的各种严重副作用，科学家们正在寻找安全有效的替代治疗方法。研究重点转向从天然产物中，特别是从植物及其部分中提取的化合物，以开发安全有效的抗癌药物。1940年至2014年间，有175种小分子化合物被批准用于癌症治疗，其中49%（85种）是天然产物或直接从天然来源提取的[23]。事实上，早期研究已经发现天然产物的植物成分是EGFR[24]、[25]、[26]以及其他与癌症相关的蛋白质的强大抑制剂[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]。许多来自微生物、植物和海洋生物的天然物质在阻止癌细胞生长、诱导细胞凋亡以及针对肿瘤发展和转移的关键信号通路方面显示出潜力。在本研究中，我们使用了包含2000种天然产物化合物的数据库，并采用了计算机模拟方法（分子对接和分子动力学（MD）模拟）来识别一种针对EGFR过度表达癌症的强效EGFR酪氨酸激酶抑制剂。此外，我们使用了野生型EGFR激酶域和吉非替尼（一种标准药物）作为对照进行比较。尽管临床试验被广泛认为是药物发现和开发的金标准，但计算机模拟方法在早期临床前和发现阶段提供了显著的时间和成本节省机会。
章节片段
蛋白质和配体制备
EGFR激酶域（EGFR TK）的晶体结构来自RCSB蛋白质数据库（PDB ID：4WKQ；分辨率：1.85 ?）（
https://www.rcsb.org/structure/4WKQ），该结构处于与FDA批准的药物吉非替尼结合的活性构象。使用Chimera X去除了水分子和共晶配体，并使用Modeller软件对蛋白质结构中缺失的残基进行了建模。为了验证序列对应性和域身份，EGFR TK和
分子对接和先导优化
分子对接是一种强大的技术，有助于阐明蛋白质和配体之间的结合性质和相互作用。在本研究中，我们进行了分子对接以识别潜在的EGFR TK抑制剂。首先，我们使用目标蛋白的共结晶配体（吉非替尼）验证了对接方法的有效性，发现共配体的RMSD值为0.48 ?，表明对接过程准确（图S2）。
结论
在本研究中，我们采用了计算机模拟方法，结合了成熟的计算工具（分子对接、ADMET分析、MD模拟、MM-GBSA计算和主成分分析），以识别最有效的天然产物植物化学物质作为EGFR酪氨酸激酶抑制剂，以抑制EGFR的过度表达。我们将标准EGFR抑制剂吉非替尼（GF）作为研究的对照。我们进行了分子对接并设置了结合亲和力
CRediT作者贡献声明
Smita Manjari Panda：撰写 – 审稿与编辑、撰写 – 原始草稿、可视化、验证、调查、形式分析、数据管理、概念化。Umakanta Tripathy：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、资源协调、项目管理、资金获取、概念化
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
资金支持
感谢印度新德里的教育部提供的财政援助（MHRD/(FDC)/2015–2016/438/INST）。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢丹巴德的IIT (ISM)提供的必要基础设施和财政支持，感谢HPC（Chandrashekhar）设施，以及印度新德里的教育部提供的财政援助（MHRD/(FDC)/2015-2016/438/INST），用于建立计算设施。同时感谢班加罗尔IISc的Anand Srivastava博士进行的富有成果的讨论。
