富马酸二甲酯通过直接靶向核糖体蛋白S6激酶A1抑制角质形成细胞过度增殖并改善银屑病

《Journal of Pharmaceutical Analysis》：Dimethyl fumarate inhibits keratinocyte hyperproliferation and ameliorates psoriasis via directly targeting ribosomal protein S6 kinase A1

　　

富马酸二甲酯（dimethyl fumarate, DMF）是银屑病（psoriasis）的一线治疗药物，具有确切的疗效和显著的治疗效果。角质形成细胞（keratinocyte, KC）过度增殖是银屑病的核心致病特征，但DMF调控KC过度增殖的确切机制长期不清。在该研究中，研究人员证明DMF在咪喹莫德（imiquimod, IMQ）诱导的银屑病小鼠模型以及多炎症因子刺激的KC中均可抑制KC过度增殖。研究人员发现，DMF通过直接靶向核糖体蛋白S6激酶A1（ribosomal protein S6 kinase A1, RSK1）的Cys432位点发挥效应。通过抑制RSK1激酶活性，DMF可导致其下游底物蛋白——腺苷三磷酸/腺苷二磷酸（adenosine triphosphate/adenosine diphosphate, ATP/ADP）转位酶1（translocase 1, ANT1）发生去磷酸化。这一抑制作用进而减弱了ANT1-第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog, PTEN）诱导的假定激酶1（PTEN induced putative kinase 1, PINK1）-Parkin轴介导的线粒体自噬（mitophagy）。尤为重要的是，小鼠表皮特异性敲低RSK1能够抑制银屑病中的KC过度增殖，且这一效应无法被DMF处理进一步影响。综上所述，该研究揭示了DMF靶向RSK1以抑制银屑病KC过度增殖的新机制，为阐明其治疗疗效提供了新见解，并确立了RSK1作为银屑病治疗潜在靶点的地位。

研究背景：银屑病（psoriasis）是一种以角质形成细胞（keratinocyte, KC）过度增殖为特征的慢性炎性皮肤病。在银屑病病理过程中，KC作为主要的效应细胞，其过度释放抗菌肽及炎症因子，与免疫细胞相互作用，形成自我放大的炎症循环，最终导致表皮增厚和斑块形成。富马酸二甲酯（dimethyl fumarate, DMF）作为内源性三羧酸循环（Krebs cycle）中间产物富马酸的衍生物，已被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration, FDA）批准用于中重度斑块状银屑病的一线系统治疗。尽管DMF疗效确切且长期安全性良好，但患者间存在显著疗效差异，部分患者效果有限甚至出现不良反应。既往研究多集中于DMF的抗炎及免疫调节作用，如调节调节性T细胞（regulatory T cell, Treg）与T辅助细胞17（T helper 17 cell, Th17）平衡，而其作为非免疫抑制剂直接抑制KC过度增殖的核心分子靶点与机制长期不明确。同时，丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）/细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase, ERK）通路在银屑病中过度激活，核糖体蛋白S6激酶A1（ribosomal protein S6 kinase A1, RSK1）作为该通路下游关键激酶，其下游底物及在KC增殖中的具体作用尚待阐明。为深入揭示DMF控制KC过度增殖的直接作用靶点，以解释其疗效差异并优化治疗策略，该项研究在《Journal of Pharmaceutical Analysis》上开展。

研究人员所开展的研究、核心结论与意义：该研究整合活性蛋白质组学、药理学与分子生物学方法，在IMQ诱导的银屑病小鼠模型和多炎症因子（M5）刺激的HaCaT细胞模型中，系统阐明了DMF抑制KC过度增殖的机制。研究明确DMF通过共价修饰RSK1的Cys432位点抑制其激酶活性，造成下游底物腺苷三磷酸/腺苷二磷酸（adenosine triphosphate/adenosine diphosphate, ATP/ADP）转位酶1（translocase 1, ANT1）去磷酸化，进而阻遏第10号染色体缺失的磷酸酶与张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog, PTEN）诱导的假定激酶1（PTEN induced putative kinase 1, PINK1）-Parkin轴介导的线粒体自噬，从而缓解KC过度增殖。该研究为DMF的作用机制提供了全新解释，确立了RSK1在银屑病治疗中的潜在靶点地位。

主要关键技术方法：研究人员主要采用基于活性的化学蛋白质组学技术、药理学及分子生物学手段，利用IMQ诱导的银屑病小鼠模型和M5（TNF-α、IL-1α、IL-17A、IL-22及OSM）刺激的HaCaT细胞模型，结合流式细胞术、免疫荧光、免疫印迹（Western blotting, WB）、免疫沉淀（immunoprecipitation, IP）联合质谱（mass spectrometry, MS）、表面等离子体共振（surface plasmon resonance, SPR）、分子对接、细胞热迁移分析（cellular thermal shift assay, CETSA）、透射电子显微镜（transmission electron microscopy, TEM）及腺相关病毒（adeno-associated virus serotype 9, AAV9）介导的体内基因递送等技术开展研究。

研究结果：
**DMF在体内和体外抑制KC过度增殖**：在IMQ诱导的银屑病小鼠模型中，DMF剂量依赖性地改善背部皮损表型，降低银屑病面积和严重程度指数（psoriasis area and severity index, PASI）评分，减轻体重下降，减少表皮增厚并降低Ki-67⁺细胞数量。在M5（10 ng/mL每种因子）刺激的HaCaT细胞中，DMF显著抑制Ed leakage of 5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（5-ethynyl-2'-deoxyuridine, EdU）阳性细胞比率及克隆形成能力，并降低Ki-67表达，表明DMF在体内外均能有效抑制KC过度增殖。
**DMF通过靶向RSK1抑制KC过度增殖**：研究人员利用线性半胱氨酸活性蛋白质组学（streamlined cysteine activity-based protein profiling, SLC-ABPP）结合串联质谱标签（tandem mass tag, TMT）标记和液相色谱串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry, LC-MS/MS），在M5刺激的HaCaT细胞中鉴定出79个DMF潜在靶蛋白，其中RSK1为排名前列的高置信候选蛋白。IAA-yne探针下拉实验和CETSA分析证实DMF与RSK1存在直接结合。研究人员还发现银屑病患者皮损中RSK1表达上调。通过在KC中敲低RSK1并利用M5刺激，发现此时DMF对KC增殖的抑制作用不再增强，表明DMF通过靶向RSK1依赖性地抑制KC过度增殖。
**RSK1的Cys432位点琥珀酰化对DMF的药效至关重要**：通过SPR分析，研究人员发现DMF与野生型RSK1蛋白的结合力较强，而与C432S突变体蛋白的亲和力显著降低。在IAA-yne探针与重组蛋白的标记实验中，DMF无法与C432S突变体有效竞争，表明Cys432位点是DMF与RSK1共价结合的关键位点。分子对接进一步显示DMF与位于RSK1蛋白ATP结合口袋内的Cys432位点形成共价结合。在KC中过表达野生型RSK1可恢复DMF的抑制效应，而过表达RSK1 C432S突变体则消除了DMF对增殖标志物Ki-67、克隆形成及EdU掺入的抑制作用，证明该位点对DMF抑制KC过度增殖不可或缺。
**DMF抑制RSK1激酶活性及ANT1磷酸化**：利用IP-MS技术，研究人员筛选出ANT1为DMF调控的RSK1相互作用蛋白。免疫共沉淀实验显示，DMF处理后RSK1与ANT1的结合被削弱，同时ANT1蛋白表达降低。利用ADP-Glo^TM激酶活性检测，研究人员证实DMF剂量依赖性地抑制RSK1对ANT1的磷酸化，其半抑制浓度（half-maximal inhibitory concentration, IC₅₀）约为54.89 μM，而C432S突变几乎消除了这种抑制效应。此外，在KC中过表达ANT1可有效挽救DMF对KC增殖的抑制，揭示ANT1是介导DMF抗增殖作用的关键下游底物。
**DMF通过RSK1抑制PINK1-Parkin通路介导的线粒体自噬**：研究人员发现DMF处理可显著降低微管相关蛋白轻链3B（light chain 3B, LC3B）-II/LC3B-I比值，增加p62（sequestosome 1, SQSTM1）积累，且在溶酶体抑制剂BafA1存在时，p62积累进一步增强，表明DMF抑制自噬流。共免疫沉淀显示DMF抑制PINK1与Parkin之间的相互作用。经MitoSOX探针和JC-1染色分析，DMF减少了线粒体活性氧（reactive oxygen species, ROS）生成，并恢复线粒体膜电位。免疫荧光共定位分析表明DMF降低线粒体外膜转位酶20同源物（translocase of outer mitochondrial membrane 20 homolog, TOM20）与LC3B的共定位，而TEM观察证实DMF减少含有受损线粒体的自噬体。使用小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）敲低RSK1后，DMF对线粒体自噬相关指标（包括LC3B转换、p62积累、PINK1-Parkin互作、线粒体ROS及膜电位）的抑制效应均被逆转，证明DMF通过RSK1依赖性地抑制ANT1-PINK1-Parkin轴介导的线粒体自噬。
**DMF通过RSK1在体内抑制ANT1-PINK1-Parkin通路及KC过度增殖**：研究人员通过局部皮内注射AAV9-shRSK1构建表皮特异性RSK1敲低小鼠模型，再进行IMQ致敏。结果发现，在RSK1敲低条件下，DMF对PASI评分、体重下降、表皮厚度及Ki-67⁺细胞数量的改善作用被显著削弱。免疫荧光证实DMF对RSK1和ANT1相互作用的破坏作用，免疫印迹结果显示DMF对ANT1和线粒体自噬标志物的抑制效应在RSK1缺失后亦显著减弱，进一步验证RSK1在DMF发挥体内抗银屑病作用中的核心地位。

总结讨论与结论：该研究指出，银屑病的治疗面临病理机制复杂和个体差异显著的双重挑战。既往对DMF的认知多局限于其核因子E2相关因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）通路激活及免疫调节作用，该研究首次通过活性蛋白质组学策略明确RSK1是DMF在KC中的直接作用靶点。DMF通过共价结合RSK1的Cys432位点，抑制其激酶活性，导致ANT1去磷酸化，进而阻断线粒体自噬，最终抑制KC过度增殖。这一发现不仅解释了DMF的疗效机制，还揭示了一种新的KC增殖调控通路，为理解银屑病发病机制提供了新视角。研究人员在结论中明确：该研究揭示了DMF抑制KC过度增殖的新靶点及其潜在分子机制，表明DMF通过靶向RSK1来抑制银屑病的KC过度增殖，为阐明其治疗疗效提供了新见解，并确立了RSK1作为银屑病治疗潜在靶点的地位。