帕金森病中多巴胺能神经元的选择性脆弱性揭示了PRKN与CHCHD2和GPNMB差异表达之间的关联

《Cell Death & Disease》：Selective vulnerability of dopaminergic neurons in Parkinson’s disease connects PRKN and differential expression of CHCHD2 and GPNMB

　　

帕金森病（Parkinson's disease, PD）中多巴胺能神经元选择性脆弱性的机制在很大程度上仍不明确。为深入理解线粒体参与及相关通路在该选择性脆弱性中的作用，研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建的酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）-mCherry报告基因诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells, iPSCs），在分化为含多巴胺能神经元的细胞培养体系后，将神经元分选为纯化的TH阳性和TH阴性群体。研究人员对PD患者与对照组的多巴胺能神经元及非多巴胺能神经元的线粒体功能进行了表征，并在两种细胞群体中鉴定了患者与对照组之间的差异表达基因。结果显示，多巴胺能神经元的线粒体膜电位低于非多巴胺能神经元；PRKN突变携带者的ATP水平低于对照组，且仅在TH阳性神经元中线粒体质量降低，而TH阴性神经元中无此现象。重要的是，研究人员在PRKN突变携带者中证实多巴胺水平升高，而多巴胺可作为有毒氧化多巴胺的重要来源。通过无偏倚RNA测序（RNA sequencing, RNA-Seq），研究人员检测到与对照组相比，PRKN突变携带者的TH阳性神经元中CHCHD2表达升高、GPNMB表达降低。这提示这三个PD基因可能在多巴胺能神经元特异性氧化应激增加的背景下存在相互作用，进而导致多巴胺能神经元的选择性脆弱性。

该研究聚焦于帕金森病（PD）中多巴胺能神经元选择性死亡的机制这一核心科学问题。目前，PD作为全球第二大神经退行性疾病，其病理特征为中脑黑质致密部多巴胺能神经元的进行性丢失，但为何这类神经元特别易感始终是未解之谜。现有诱导多能干细胞（iPSC）分化协议仅能产生20%-30%的多巴胺能神经元，混合培养体系严重制约了对神经元类型特异性病理机制的解析。此外，约15%的PD病例具有遗传病因，其中PRKN基因突变导致最常见的常染色体隐性遗传型PD，但其具体致病机制尚不完全清楚。研究人员推测，线粒体功能障碍可能在多巴胺能神经元的选择性脆弱性中发挥关键作用，因此亟需建立能够分离纯化多巴胺能神经元的疾病模型，以深入探究PRKN突变背景下的细胞类型特异性病理改变。

研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在两名复合杂合PRKN突变携带者（PRKN PD 1：Del ex4 + c.823C>T；PRKN PD 2：c.823C>T; c.1054T>C）及健康对照的iPSC中，将mCherry荧光蛋白编码序列敲入TH基因终止密码子上游，构建TH-mCherry报告基因细胞系。经胚胎体形成实验验证三胚层分化潜能后，按已发表方案将iPSC分化为多巴胺能神经元，于分化第35天通过荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting, FACS）分离mCherry阳性（TH⁺）和阴性（TH^-）神经元，重新培养至45-60天进行后续分析。RNA测序样本来源于两个独立分化批次，每组包含对照与两名PRKN突变者的TH⁺和TH^-细胞各三例，采用Illumina NextSeq2000平台测序，通过DRAGEN RNA流程进行数据处理和基因表达定量。差异表达分析使用DESeq2 R包，以批次和疾病状态为协变量构建负二项广义线性模型，筛选标准为|log₂折叠变化| ≥ 1且FDR校正p值<0.05。交互作用分析采用设计公式~批次 + 细胞类型 + 疾病状态 + 细胞类型:疾病状态，提取交互项识别疾病相关表达变化具有细胞类型差异性的基因。通路富集分析应用clusterProfiler包进行基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）分析。此外，研究还涉及JC-1染料检测线粒体膜电位、ATP-lite试剂盒测定ATP合成、CellRox Green检测活性氧（reactive oxygen species, ROS）、高效液相色谱（high performance liquid chromatography, HPLC）定量多巴胺、Western blot检测特定蛋白表达等分子生物学技术；活人成纤维细胞样本来源于四名无PRKN突变的健康对照和四名PRKN突变PD患者（P1-P4），用于GPNMB蛋白水平的验证。

**TH-mCherry报告基因系的构建与多巴胺能神经元的纯化分离**

通过Sanger测序验证mCherry正确整合后，研究人员获得可稳定传代的TH-mCherry报告基因iPSC克隆。免疫荧光和qRT-PCR证实所有细胞系均表达OCT4、NANOG、TRA-1-60、SSEA4等 pluripotency markers，且分化第35天神经元培养物中TH蛋白水平在对照与PRKN突变者间无差异。FACS分选显示约22%细胞为mCherry⁺，该比例在两组间无差异；非分选培养物中mCherry⁺与TH⁺神经元完全共定位（Pearson系数验证）。分选后再培养的mCherry⁺细胞相比输入培养物和mCherry^-细胞分别实现3.06倍和4.25倍的TH⁺神经元富集。Western blot证实mCherry⁺神经元特异性表达TH和多巴胺脱羧酶（dopamine decarboxylase, DDC），RNA-Seq显示其显著富集多巴胺能神经元特异性通路，DBH/TH比值极低排除去甲肾上腺素能神经元污染，表明该模型可有效分离纯化多巴胺能神经元。

**线粒体蛋白水平与功能在PRKN突变携带者中的改变**

研究人员检测了参与线粒体融合的Mitofusin 2（MFN2）和线粒体外膜转位酶20（TOMM20）的蛋白水平。结果仅在TH⁺神经元中观察到PRKN突变者的MFN2和TOMM20蛋白显著降低，TH^-神经元中则无此差异。线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential, MMP）检测显示，TH⁺神经元普遍低于TH^-神经元，但PRKN突变者与对照组间无显著差异。ATP水平测定发现，TH⁺神经元中PRKN突变者显著低于对照，而TH^-神经元中反而升高，呈现相反的细胞类型特异性模式。ROS检测显示非分选培养物中两组无差异；TH^-神经元中PRKN突变者升高1.56倍，TH⁺神经元中则降低2.23倍，提示线粒体功能受损导致ROS生成减少。

**差异基因表达分析揭示CHCHD2和GPNMB为关键调控因子**

PCA分析显示PRKN突变者与对照明确分离。TH⁺神经元中鉴定出383个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），TH^-神经元中271个，其中191个为共享DEGs。CHCHD2在两种细胞类型中均为上调最显著的共享基因之一；GPNMB则表现为TH⁺神经元中最显著下调的基因之一，但在TH^-细胞中无此变化。交互作用分析确认8个基因在TH⁺细胞中变化更显著。GO分析显示共享下调通路为"泛素-蛋白转移酶活性调控"和"泛素-蛋白转移酶活性的正调控"；TH⁺细胞特异性下调包括"细胞质翻译"、"核糖体结构成分"等，上调包括"纤毛运动"、"轴丝组装"等。KEGG分析显示TH⁺细胞特异性下调通路包括蛋白酶体、蛋白质加工、铁死亡、鞘脂代谢和磷脂酰肌醇信号通路，上调包括心肌收缩、cAMP信号通路等。RT-qPCR验证证实CHCHD2 mRNA升高和GPNMB mRNA降低，且PRKN突变者中PRKN mRNA表达无差异，提示无义介导的mRNA降解未发生。

**CHCHD2和GPNMB蛋白表达的细胞类型特异性验证**

研究人员检测了GPNMB和CHCHD2的蛋白表达。GPNMB为高度糖基化膜蛋白，Western blot未在iPSC衍生神经元中检测到，但在成纤维细胞中成功检测；经Endo H去糖基化处理确认抗体特异性后，比较四名健康对照与四名PRKN突变患者成纤维细胞发现，患者GPNMB蛋白水平降低，与RNA-Seq数据一致。CHCHD2蛋白仅在TH⁺神经元中检测到，TH^-神经元和成纤维细胞中未检测到，且PRKN突变者表达高于对照，与转录组数据相符。

在讨论部分，研究人员指出该细胞模型相比现有混合培养体系的关键优势在于可实现PD相关多巴胺能神经元的纯化分离，此前工作已证明纯化TH⁺神经元具有更高的电兴奋性。模型验证显示约22%的mCherry⁺神经元得率，再培养后实现3倍以上富集，可有效形成神经元网络。

关于多巴胺合成，TH和DDC蛋白在PRKN突变者与对照间无差异，但PRKN突变者TH⁺神经元中多巴胺水平显著升高，提示多巴胺积累及其氧化为氧化多巴胺可能导致神经毒性，这与DJ-1敲除小鼠中多巴胺水平升高导致黑质氧化多巴胺积累和神经元丢失的研究一致。

线粒体功能方面，MFN2和TOMM20在PRKN突变者TH⁺神经元中选择性降低，这与Parkin通过泛素化调控二者降解的功能预期相反，但与其他多巴胺能毒性模型中MFN2降低的结果一致，提示多巴胺能细胞在Parkin-MFN2-TOMM20轴上具有特殊性状。MMP在TH⁺神经元中普遍较低，与多巴胺能神经元高能量需求和电生理活性所需ATP及钙离子增加有关。ATP降低与既往iPSC衍生神经元和患者成纤维细胞研究一致；TH^-神经元中ATP升高则可能反映其代偿性高能量需求。ROS结果出人意料：仅TH^-细胞升高而TH⁺神经元降低，这可能反映基础状态下的特殊代谢状态，也凸显了FACS分选在揭示混合培养所掩盖的细胞类型特异性表型中的关键价值。

CHCHD2作为氧化磷酸化介导者和电子传递链电子流调控因子，其在PRKN突变者中上调可能为缓冲ROS增加的代偿机制，既往研究显示CHCHD2可响应线粒体应激而上调。果蝇中Chchd2对神经元完整性必需，且pink1或Parkin缺失加剧Chchd2相关神经缺陷，提示Parkin与CHCHD2协同维持多巴胺能神经元稳态。

GPNMB降低可能代表代偿机制或参与替代性分子通路，避免α-突触核蛋白（α-Synuclein）积累导致的选择性脆弱。近期研究将GPNMB与LRRK2关联，使其成为PD的潜在生物标志物。

研究的局限性包括：未测定氧消耗率；免疫荧光与FACS结果的差异可能源于通透化处理中的抗原丢失；细胞系数量有限，尚需等基因对照和更大样本验证。

**研究结论**：研究人员建立了PD的iPSC衍生模型，该模型允许研究PRKN突变携带者的纯化多巴胺能神经元，易于推广至其他PD相关基因；通过揭示线粒体功能障碍与多巴胺水平升高的关联，为多巴胺能神经元选择性脆弱性提供了新见解；识别了CHCHD2和GPNMB在该过程中的新生物学作用；该模型不仅对单基因型PD有重要意义，对线粒体功能障碍同样发挥重要作用的常见散发性PD也具有广泛参考价值。