人类诱导的谷氨酸能神经元的电生理学和蛋白质组学研究路线图：为病理生理学研究优化培养条件

《Cell Death Discovery》：An electrophysiological and proteomics roadmap for human induced glutamatergic neurons: fine-tuning of culture conditions for pathophysiological studies

　　

摘要

通过在人类多能干细胞中过表达Neurogenin-2（NGN2）生成的诱导性谷氨酸能神经元（iGluNeurons）是研究人类神经元成熟和功能的强大模型；然而，基于NGN2的培养方案仍缺乏标准化的培养条件，这些条件对神经元的发育和功能具有重要影响。先前的文献已经确定了三个关键因素：细胞外基质涂层的组成、初始接种密度以及培养基的选择，但它们组合的差异效应尚未得到充分分析。在本研究中，我们探讨了这三个变量的组合效应，测试了八种不同的培养条件，这些条件是由两种涂层（聚L-鸟氨酸和聚乙烯亚胺）、两种培养基（BrainPhys和Neurobasal）以及两种细胞密度（4800个细胞/平方毫米和1200个细胞/平方毫米）组合而成的。我们评估了单细胞和网络层面的电生理特性，并在多个发育阶段分析了形态功能及蛋白质组特征。电生理数据表明，培养基组成和接种密度而非基底涂层决定了神经元的成熟动态：BrainPhys和高密度条件促进了快速但短暂的神经元成熟，而Neurobasal和低密度条件则支持渐进且持续的网络发育。对突触和轴突起始段的形态功能分析，以及神经元成熟标志物的研究，表明早期发育过程主要由BrainPhys驱动，随后被Neurobasal超越。为了实现对包含人类神经元和大鼠星形胶质细胞的iGluNeuron系统的精确蛋白质组分析，我们开发了一种强大的分类过滤算法，该算法能够选择性识别人类特异性蛋白质。这种方法证实，在所有培养条件下都存在由NGN2驱动的分化通路的保守核心，同时还存在条件特异性的特征。最后，在通过实验分析确定的最佳条件下，观察到了强烈的自发性和诱发性突触活动。这些结果为优化iGluNeuron培养提供了框架，实现了快速成熟与长期功能稳定性的平衡，并为疾病研究和药物筛选中的人类神经元模型建立了基准。