通过抑制二氢乳清酸脱氢酶活性的小分子干扰Notch信号传导

《Scientific Reports》：Disrupting Notch signalling by a small molecule inhibiting dihydroorotate dehydrogenase activity

　　

Notch信号通路（Notch signalling pathway）在进化上高度保守，调控大多数器官的分化和稳态。鉴于Notch信号在正常发育中的关键作用，失调的Notch信号常与疾病和癌症的发病机制相关。因此，开发靶向Notch的治疗方法是有必要的，但一直具有挑战性，Notch抑制剂尚未达到广泛的临床应用。在本报告中，研究人员利用一种新型的基于细胞的Notch报告系统（cell-based Notch reporter system）进行无偏筛选降低Notch信号的化合物，从而鉴定潜在的Notch抑制剂。对包含37,966种小有机化合物的文库进行了候选抑制剂筛选，随后进行了反筛以排除γ-分泌酶抑制剂（γ-secretase inhibitor, GSI）样化合物，以及基于Notch信号在肌原分化（myogenic differentiation）中作用的正交筛选。这一分选过程鉴定出五种具有不同化学骨架且与先前Notch拮抗剂无关的候选Notch抑制剂命中化合物。其中一个候选命中被证明是二氢乳清酸脱氢酶抑制剂（dihydroorotate dehydrogenase inhibitor, DHODH inhibitor），研究人员还提供证据表明一种公认的DHODH抑制剂是一种高效的Notch抑制剂。总之，这些数据支持DHODH抑制可能是探索开发新型Notch抑制剂的一个有趣途径。

**研究背景与问题**
Notch信号通路（Notch signalling pathway）在进化上高度保守，调控大多数组织的分化和稳态。由于该通路在正常发育中的关键作用，其失调（通常由受体功能获得性突变或间接过度激活引起）与多种疾病和癌症（如T细胞急性淋巴细胞白血病、三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌等）密切相关。尽管开发靶向Notch的治疗方法迫在眉睫，但现有策略面临显著挑战：γ-分泌酶抑制剂（GSIs）虽能阻断所有Notch受体的S3切割，却导致严重的副作用（如杯状细胞化生、免疫抑制和皮肤癌）；其他小分子抑制剂（如CB-103）或受体特异性抗体虽处于临床前或临床试验阶段，但仍未实现常规临床使用。因此，需要开发新型、非GSI依赖的Notch抑制剂。本研究旨在通过无偏高通量筛选，发现具有新颖化学骨架的Notch抑制剂候选物。

**研究内容与结论**
研究人员开发了一种基于细胞的新型Notch报告系统，直接记录Notch受体激活后的即时信号（而非下游Hes/Hey基因），用于筛选37,966种小分子化合物。通过反筛排除潜在的GSI（利用APP-C99报告系统）和正交筛选（基于Notch在C2C12肌原分化中的作用），最终鉴定出五种候选抑制剂（化合物A-E）。其中化合物C被证实为二氢乳清酸脱氢酶（DHODH）抑制剂，且公认的DHODH抑制剂BAY2402234显示出强大的Notch抑制活性（IC₅₀ = 11 nM）。该研究揭示了DHODH与Notch信号之间的新联系，为开发基于DHODH抑制的Notch靶向策略奠定了基础。论文发表于《Scientific Reports》。

**主要关键技术方法**
1. **高通量筛选（HTS）**：基于HEK293T细胞构建稳定表达Notch^ΔE（模拟S2切割的配体非依赖型受体）和CSL-荧光素酶报告基因的双荧光素酶系统，用于检测Notch下游即时信号。
2. **反筛**：使用APP-C99报告系统，评估化合物对γ-分泌酶活性的影响，排除GSI样分子。
3. **正交验证**：利用C2C12肌母细胞肌原分化实验，通过MYH4免疫荧光和融合指数评估Notch抑制效能。
4. **DHODH酶活性测定**：基于荧光法检测候选化合物对DHODH的抑制作用，并通过尿苷补救实验验证机制。
5. **下游效应分析**：通过qRT-PCR、Western blot和表面生物素化实验分析Notch靶基因表达及受体稳定性。

**研究结果**
- **新型Notch报告系统**：构建的CSL-荧光素酶报告细胞系（克隆A1-11）在384孔板中稳定工作，Z因子>0.5，可动态读取DAPT（GSI）介导的信号抑制，适用于HTS。
- **小分子文库筛选**：37,966种化合物初筛获得189个候选者（信号降低>70%且Renilla变化<25%），经三剂量确认（1.25、10、25 μM）后103个符合标准。
- **排除潜在GSI**：通过APP-C99反筛（阈值70%抑制），53个化合物通过；经PAINS、REOS过滤及11-点剂量响应分析，保留39个候选者。
- **鉴定五种抑制剂**：基于化学结构多样性和类似物分析，选出16个化合物及其47个类似物，经14-点剂量响应获得五个候选物（A-E），IC₅₀范围为0.73 μM至4 mM。
- **肌原分化正交实验**：化合物A、C、E处理C2C12细胞5天后，MYH4表达显著升高，诱导多核肌管形成，证实其Notch抑制活性。
- **肿瘤细胞生长抑制**：化合物B和C显著抑制NOTCH1依赖的T-ALL细胞系（JURKAT、RPMI-8402）及乳腺癌细胞系（MDA-MB-436、MDA-MB-468、BT-20）的代谢活性，IC₅₀在0.3–6.7 μM之间。
- **化合物C是DHODH抑制剂**：化合物C在DHODH酶活性测定中表现出剂量依赖性抑制，且100 μM尿苷可逆转其对Notch报告信号的抑制；公认的DHODH抑制剂BAY2402234在Notch报告实验中IC₅₀为11 nM，效力比化合物C高15倍。
- **化合物C降低HES-1蛋白水平**：在MDA-MB-231和JURKAT细胞中，化合物C（2 μM, 48 h）降低NOTCH1 ICD和HES-1蛋白水平，但不影响NOTCH1表面定位；环己酰亚胺实验显示NOTCH1 ICD半衰期从5.6 h缩短至4.5 h。

**讨论与结论**
讨论部分指出，DHODH与Notch信号之间的机制联系有待进一步阐明，可能涉及NOTCH1 ICD稳定性降低或通过p53、MYC等间接途径。DHODH抑制剂（如来氟米特）已在类风湿关节炎、多发性硬化症等疾病中应用，因此理解其脱靶Notch抑制效应具有临床重要性。与现有Notch抑制剂（如CB-103、GSI）相比，化合物C在肌原分化实验中表现出更强活性，但c-MYC上调等现象提示不同抑制剂作用机制存在差异。
**研究结论**：总之，研究人员通过无偏小化合物筛选（监测Notch下游激活水平）获得了多种类型的抑制剂命中，并重要地揭示了DHODH与Notch信号之间的联系。这将为基于DHODH抑制的新型Notch抑制策略奠定基础，也可能为当前临床使用的DHODH抑制剂的潜在Notch脱靶效应提供信息。