细菌益生菌提取物与绿色纳米颗粒的整合作为一种安全的保护历史手稿免受真菌劣化的方法：一项应用研究

《Scientific Reports》：An integration of bacterial probiotic extract and green nanoparticles as a safe approach for conservation of historical manuscript against fungal deterioration: an applied study

　　

本研究专注于整合一种环境友好（eco-friendly）、成本效益（cost-effectiveness）且安全的方法来保护历史手稿，以避免使用传统保护方法和合成杀菌剂带来的风险，这些方法对环境、人类健康和历史博物馆材料构成危险影响。因此，研究人员评估了一部11世纪历史手稿的劣化方面，包括其纸张和皮革装订，与相应真菌群落的影响相关。使用摄影记录、扫描电子显微镜（SEM）、X射线衍射（XRD）、衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）、颜色变化和pH值（与对照样品比较）来检查劣化方面。灰尘、污垢、腐蚀、污渍、脆弱、缺失部分、纸张结晶度降低、纤维素波数变化、颜色变化和酸性被确定为最严重的降解因素。从历史手稿中分离出13种真菌菌株，并通过形态学和分子学鉴定为黄曲霉（Aspergillus flavus）（5个分离株）、中华曲霉（A. chinensis）（1个分离株）、产黄青霉（Penicillium chrysogenum）（1个分离株）、快速枝孢霉（Cladosporium velox）（1个分离株）、拟青霉（Paecilomyces variotii）（2个分离株）、棕拟青霉（Paecilomyces brunneolus）（1个分离株）、泰米尔纳德弯孢霉（Curvularia tamilnaduensis）（1个分离株）和膝曲弯孢霉（Curvularia geniculate）（1个分离株）。这些菌株显示出产生参与生物劣化的不同水解酶的高活性，包括纤维素酶（cellulase）、淀粉酶（amylase）、明胶酶（gelatinase）和果胶酶（pectinase）。使用创新和开创性的环保生物材料实现了对历史手稿免受真菌劣化的保护：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）提取物（100 μg mL^-1）随后是绿色合成的TiO₂-NPs（100 μg mL^-1）。还应用了其他保护技术，如清洁、加固、缺失部分补全以及所研究手稿的其他必要方法，并揭示了手稿的美学价值。

**研究背景与问题**

历史手稿、书籍和遗产文物是世界各地档案馆、博物馆和图书馆中的宝贵国家财富，但面临微生物、化学和物理劣化因素的威胁。其中，真菌引起的生物劣化是导致图书馆和档案馆馆藏劣化的重要原因之一，可造成机械腐蚀、酶降解和酸腐蚀，导致美学和结构价值的损毁。传统上，使用化学品、挥发性油和臭氧等方法来管理微生物劣化，尤其是真菌劣化，但这些方法存在成本高、危害环境和人类健康等问题。因此，研究人员迫切需要开发快速、安全、有效、经济且环境友好的新型保护剂。益生菌菌株（如植物乳杆菌Lactobacillus plantarum）能够产生多种具有抗菌活性的代谢物（如细菌素、脂肪肽、蛋白酶等），有望用于微生物劣化控制。同时，利用益生菌代谢物绿色合成的纳米颗粒（如TiO₂-NPs）也具有良好的抗真菌特性。本研究旨在探索将益生菌植物乳杆菌提取物及其生物合成的TiO₂-NPs整合用于保护受真菌劣化的历史手稿，这是首次针对历史手稿采用这种保护策略的研究。

**研究内容与结论**

研究人员选取了一部来自埃及开罗爱资哈尔图书馆（Al-Azhar Library）的11世纪历史手稿（1158 AH, 1746 AD，编号113506/6214），存储条件恶劣（温度27 °C，相对湿度>60%，通风不良）。首先，评估手稿纸张和皮革装订的劣化状态；其次，分离并鉴定相关的真菌群落；然后，测试真菌分泌水解酶（纤维素酶、淀粉酶、明胶酶、果胶酶）的活性；利用多种分析技术检测劣化特征；最后，应用植物乳杆菌提取物（100 μg mL^-1）和绿色合成的TiO₂-NPs（100 μg mL^-1）进行生物控制，并结合机械清洁、化学清洁、加固、补全等保护处理。研究表明，该整合方法能有效控制真菌生长，并保护手稿，恢复了其美学价值。论文发表在《Scientific Reports》。

**关键技术方法**

- 样本队列来源：历史手稿来自埃及开罗爱资哈尔图书馆（Al-Azhar Library）；对照样品采用Whatman No.1滤纸（98%纤维素，英国Whatman公司）和植物鞣制山羊皮（参照Abdel-Maksoud et al. 2016方法制备）。
- 真菌分离与鉴定：采用形态学（基于标准鉴定图谱）和ITS序列分子鉴定（引物ITS1/ITS4，PCR扩增后测序，系统发育树MEGA v6.1构建）。
- 酶活性测定：利用琼脂平板法（含CMC、淀粉、明胶、果胶的矿物盐培养基）检测纤维素酶、淀粉酶、明胶酶、果胶酶活性，通过特定染色后测量透明圈直径。
- 劣化表征技术：摄影记录（三星38 MP相机）；环境扫描电子显微镜（ESEM，Quanta 3D 200i）观察表面形貌；衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR，Bruker Vertex 70）分析化学基团变化；X射线衍射（XRD，PANalytical X’Pert Pro）测量纤维素结晶度（结晶度指数计算）；CIE Lab色差测量（便携式分光光度计）；pH值测量（纸质表面pH和皮革浸提pH）。
- 保护处理：植物乳杆菌提取物的制备（MRS培养基培养后离心取上清液，旋转蒸发浓缩至100 μg mL^-1喷雾）；绿色合成TiO₂-NPs（乳酸菌细胞悬浮液与Ti[OCH(CH₃)₂]₄反应，pH 8，200 °C干燥，100 μg mL^-1喷雾）。物理清洁（软刷、手术刀等去除灰尘、胶带残留）；化学清洁（丙酮、乙醇/水混合液等去除污渍）；加固与补全（甲基纤维素3%和羟丙基纤维素Klucel G作为粘合剂和加固剂，使用日本纸和纸浆）。

**研究结果**

**1. 摄影记录（Photographic documentation）**：通过目视检查和数字成像发现，皮革装订显示硬度、柔韧性降低、鞣料侵蚀、缺失部分、灰尘积累和污渍等劣化形式；纸张显示字迹扭曲、霉斑、狐斑、锈斑、缺失、小孔和变色。这些劣化主要归因于不良环境条件和生物侵袭。

**2. 真菌分离与鉴定（Fungal isolation and identification）**：从劣化手稿纸张和皮革上分离出13种真菌菌株，结合形态学和ITS序列分子鉴定，其中曲霉属（Aspergillus spp.）占46.2%（主要为黄曲霉A. flavus），拟青霉属（Paecilomyces spp.）占23%，其余包括产黄青霉（Penicillium chrysogenum）、快速枝孢霉（Cladosporium velox）、泰米尔纳德弯孢霉（Curvularia tamilnaduensis）和膝曲弯孢霉（Curvularia geniculate）。序列已提交至GeneBank（登录号PZ255452–PZ255464）。

**3. 酶活性（Enzyme activity）**：除两株拟青霉外，所有菌株均能分泌纤维素酶、淀粉酶和明胶酶，所有菌株均能分泌果胶酶。其中，中华曲霉（A. chinensis）AT.1具有最高纤维素酶活性（透明圈50.5±1.0 mm）；棕拟青霉（P. brunneolus）AT.7和产黄青霉（P. chrysogenum）AT.5具有最高淀粉酶活性；中华曲霉AT.1和黄曲霉AT.11具有最高明胶酶活性；膝曲弯孢霉AT.2和产黄青霉AT.5具有最高果胶酶活性。这些水解酶参与了纸张纤维素、淀粉、明胶和果胶的分解，导致手稿材料劣化。

**4. 墨水识别（Identification of ink）**：通过ATR-FTIR分析墨水介质，确定阿拉伯树胶（gum arabic）作为黑色和红色墨水的粘合剂。XRD分析显示黑色墨水含铁碳氧化物（C₁₄Fe_1.86）和赤铁矿（Fe₂O₃），红色墨水由朱砂（HgS，硫化汞）组成。

**5. 劣化表征**：
- **环境扫描电镜（ESEM）**：历史皮革表面粗糙、不均匀，纤维断裂，颗粒表面图案消失，有真菌菌丝和孢子；历史纸张纤维弱化、宽度减小，相比对照Whatman纤维不规则且表面附有真菌和细菌。
- **ATR-FTIR**：历史皮革胶原蛋白波数发生偏移（酰胺I、II、III带强度改变），表明水解和氧化；历史纸张纤维素O-H、C-H、C=O、C-O等基团波数升高或降低，吸光度增强，指示氧化和水解过程。
- **X射线衍射（XRD）测量结晶度**：历史纸张纤维素结晶度从对照的81.68%降至47.54%，表明非晶区受损和降解。
- **颜色变化**：历史皮革L*值（亮度）降低53%，a*值（红度）增加62%，b*值（黄度）增加85%，总色差ΔE=44.6；历史纸张L*值降低18%，a*增加96%，b*显著增加，ΔE=27.5。颜色变化归因于真菌色素和酸性代谢物。
- **pH值**：历史皮革pH从对照4.1降至3.2，历史纸张pH从7.5降至5.5，表明酸性增强，促进真菌生长和材料降解。

**6. 保护研究（Conservation study）**：使用植物乳杆菌DSM-20174提取物（100 μg mL^-1）和绿色合成TiO₂-NPs（100 μg mL^-1）对历史纸张和皮革进行喷雾消毒，成功抑制了真菌生长。随后进行机械清洁（软刷、手术刀去除灰尘、胶带）和化学清洁（丙酮去除胶带残留；乙醇/水70:30去除污渍），皮革用乙醇、蓖麻油和茶树油混合物软化，用羟丙基纤维素（Klucel G）加固和补全缺失部分，最终制成无酸纸板保存盒。保护后手稿美学价值得以恢复。

**总结讨论**

研究结果表明，手稿劣化是生物（真菌分泌水解酶和酸性代谢物）、物理（温湿度波动、光照）和化学（酸性污染物）因素共同作用的结果。植物乳杆菌提取物和TiO₂-NPs的整合使用为传统杀菌剂提供了安全、环保的替代方案。机械和化学清洁方法有效去除了表面污渍和灰尘，加固材料Klucel G增强了纸张和皮革的强度。该研究首次在历史手稿保护中采用益生菌提取物与绿色纳米颗粒的协同策略，为同类文物的保护提供了新途径。

**研究结论翻译**：所研究的历史手稿显示出由于生物劣化和不当存储条件导致的显著降解。已鉴定出13种与手稿劣化相关的真菌菌株。这些真菌能分泌水解酶如纤维素酶（cellulase）、淀粉酶（amylase）、明胶酶（gelatinase）和果胶酶（pectinase），在生物劣化中起作用。大多数真菌菌株能产生所有必要的水解酶。皮革装订劣化的常见迹象包括硬度、失去柔韧性、鞣料侵蚀、灰尘积累、缺失部分以及污染或真菌污染的污渍。使用摄影记录、SEM、ATR-FTIR、XRD、pH值和颜色测量与对照样品比较，揭示了历史样品的显著劣化。ATR-FTIR和XRD帮助识别所用墨水及介质。手稿用植物乳杆菌DSM-20174（100 μg mL^-1）及其生物合成的TiO₂-NPs（100 μg mL^-1）进行消毒以保护。使用棉花、软刷、水和乙醇的机械和化学清洁技术在保护手稿方面有效。茶树油在乙醇中处理皮革装订，乙醇与氢氧化钙纳米颗粒混合物去除纸张酸性。羟丙基纤维素3%（Klucel G）用作手稿修复的粘合剂。