达格列净（DAPA）对曼氏血吸虫感染所致肝脏病理的保护效力：一项体内研究

《Scientific Reports》：Protective efficacy of dapagliflozin against schistosomiasis mansoni-induced liver pathology: an in vivo study

　　

血吸虫病是一种与显著发病率和死亡率相关的被忽视热带病。吡喹酮（PZQ）是目前唯一用于治疗人类血吸虫病的药物，但其治疗与曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）感染所致肝脏病理的不完全缓解相关。因此，亟需引入能够减轻病理事件的辅助药物。本研究旨在评估口服降糖药物达格列净（DAPA）单独及联合吡喹酮的肝脏保护效应。在本研究中，达格列净与吡喹酮联合治疗显著降低了成虫负荷和肝脏虫卵负荷，显著提高了小肠内成熟虫卵和死亡虫卵的百分比并显著降低了未成熟虫卵的百分比，显著提高了肝脏还原型谷胱甘肽（GSH）和一氧化氮（NO）水平，显著减轻了组织病理学改变，并显著减少了肉芽肿数量和直径。此外，对切割型半胱天冬酶-3（cleaved-caspase 3）的免疫组织化学研究显示，与未治疗组相比其表达增加。研究人员的发现为达格列净作为吡喹酮的有利辅助药物用于缓解血吸虫性肝脏病理提供了深入认识。未来研究需进一步探索达格列净抗曼氏血吸虫感染所致肝脏纤维化的其他保护机制通路。

血吸虫病作为一种寄生虫病，对全球健康和经济造成重大影响。尽管基于1990年至2021年的历史数据以及2022年至2030年的预测，血吸虫病负担总体呈下降趋势，但在高社会经济水平地区该病负担反而增加，提示输入性病例和气候变化等因素的重要作用。慢性肝损伤和炎症可导致肝脏纤维化，而曼氏血吸虫感染是重要诱因之一。虫卵滞留于肝血窦内可触发肉芽肿性炎症、纤维化和门脉高压，其机制涉及虫卵释放抗原所诱发的免疫反应、成虫和虫卵产生的蛋白酶导致的纤维化形成及组织损伤。肝星状细胞（HSCs）激活是刺激纤维性胶原和细胞外基质（ECM）蛋白合成的主要机制，这些细胞在纤维化形成和组织修复过程中产生大量基质成分和促炎细胞因子，并转分化为肌成纤维细胞（MFs）。炎症与活性氧和氮物质（RONs）产生增加相关，当天然抗氧化防御被高浓度RONs压制时，氧化还原失衡、氧化应激、细胞化合物永久性改变及正常细胞信号通路紊乱随之而来。氧化应激是肝脏纤维化的主要机制，通过激活HSCs并刺激MFs产生ECM蛋白和胶原积累发挥作用。感染后，先天免疫应答作为第一道防线，协调炎症和细胞死亡。凋亡是一种非裂解性、非炎症性细胞死亡，主要由半胱天冬酶（caspases）调控，后者是多细胞生物中凋亡的核心调节因子和执行者。Caspases属于半胱氨酸蛋白酶家族， executioner caspase-3通过启动因子caspase-8或caspase-9分别经外源性和内源性激活途径被切割激活。鉴于其在细胞死亡通路中的核心作用，caspases已成为炎症、感染性疾病和癌症等多种疾病的潜在治疗靶点。达格列净（DAPA）是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的钠-葡萄糖协同转运蛋白2（SGLT2）抑制剂，属于新型抗糖尿病药物，用于管理2型糖尿病。SGLT2抑制剂通过竞争性结合肾小管SGLT2蛋白上的葡萄糖结合位点，减少管腔葡萄糖重吸收，增加尿中葡萄糖、水和钠的排泄，从而降低血糖水平和容量负荷。SGLT2抑制剂的降糖效应可减少葡萄糖毒性、增强葡萄糖代谢并改善胰岛素敏感性；其非降糖保护效应包括抗炎、抗氧化、抗衰老和抗纤维化作用，以及改善线粒体功能。已有研究表明DAPA可缓解大鼠胆总管结扎诱导的肝损伤、减缓小鼠肝脏纤维化进展，并改善大鼠非酒精性脂肪性肝病相关表现。

针对上述背景，研究人员在《Scientific Reports》发表了这项研究，旨在评估DAPA抗肝脏血吸虫病的效力，采用一般情况、寄生虫学、生化、组织病理学和免疫组织化学方法进行综合研究。该研究使用埃及株曼氏血吸虫尾蚴感染BALB/c雌性小鼠，动物来源为埃及吉萨省Theodor Bilharz研究所（TBRI）的血吸虫生物供应中心（SBSC）。感染后第4至10周给予DAPA 20 mg/kg隔日灌胃，第6周给予吡喹酮500 mg/kg/天连续两日灌胃处理，于第10周处死动物进行各项指标检测。

研究涉及的主要关键技术方法包括：（1）成虫负荷检测：采用兽医用刮匙和枸橼酸盐水从肝脏和门肠系膜血管灌注液中回收成虫并计数；（2）肝脏虫卵负荷测定：4%氢氧化钾消化肝组织后显微计数虫卵；（3）小肠虫卵发育阶段分析（卵谱）：压缩法观察末端回肠虫卵的未成熟、成熟和死亡阶段；（4）肝脏组织生化检测：商用试剂盒测定还原型谷胱甘肽（GSH）和一氧化氮（NO）水平；（5）组织病理学评估：苏木精-伊红染色评估小叶炎症、局灶性坏死和肝细胞水样变性、汇管区炎症和扩张等，Masson三色染色观察肉芽肿胶原沉积并测量肉芽肿计数和直径；（6）免疫组织化学检测：检测切割型caspase-3表达，采用抗切割型caspase-3多克隆抗体，DAB显色，半定量评估阳性细胞百分比；（7）统计学分析：采用SPSS 26.0软件，正态分布数据采用方差分析（ANOVA）及Fisher最小显著差异法事后检验，非正态数据采用Kruskal-Wallis检验及Mann-Whitney检验，分类数据采用Monte Carlo检验。

研究结果部分如下：

**死亡率**：DMSO溶剂对照组和DAPA单药组各死亡1只小鼠（16.67%），其余各组无死亡。

**一般参数——肝脏和脾脏指数**：PZQ或DAPA单药治疗显著降低肝脏指数（分别降低17.59%和14.18%）和脾脏指数（分别降低43.75%和27.78%）；DAPA联合PZQ治疗亦显著降低肝脏和脾脏指数（分别降低16.88%和42.36%）。

**寄生虫学参数——成虫负荷**：PZQ单药或联合DAPA显著降低雌虫数（分别降低80%和93.33%）和总成虫数（分别降低92.86%和95.24%），两种PZQ方案均使雄虫数降低96.30%；DAPA单药对雌雄虫及总虫数无显著降低作用（分别降低11.11%、20%和14.29%）。

**肝脏虫卵负荷**：PZQ单药或联合DAPA显著降低肝脏虫卵负荷（分别降低64.59%和66.43%）；DAPA单药亦显著降低肝脏虫卵负荷（降低47.56%）。

**卵谱**：PZQ治疗显著降低未成熟虫卵百分比（7.60）并增加死亡虫卵百分比（49.48）；DAPA联合PZQ显著增加成熟和死亡虫卵百分比（分别为49.91和44.21），显著降低未成熟虫卵百分比（5.88）；DAPA单药未显著改变卵谱。

**生化参数——肝脏GSH和NO水平**：DAPA联合PZQ治疗显著增加GSH和NO水平（分别增加60.73%和61.11%）；PZQ单药对GSH和NO无显著增加（分别增加4.73%和11.90%）；DAPA单药亦无显著增加（分别增加22.18%和26.19%）。

**组织病理学研究——实质改变和汇管区炎症扩张**：未治疗感染小鼠显示显著小叶炎症和局灶性坏死、显著汇管区炎症扩张，无水样变性；PZQ治疗未显示组织病理学改变的显著改善，且出现水样变性，提示药物肝毒性；DAPA单药及联合PZQ治疗显示显著改善，无水样变性。

**肝脏肉芽肿**：未治疗感染小鼠和DMSO处理小鼠显示大量大尺寸、轮廓不规则的纤维细胞性肉芽肿，围绕活卵，平均计数分别为24.06±3.89和23.13±2.23，平均直径分别为522.22±50.18 μm和506.67±36.51 μm。PZQ治疗显示中至重度炎症细胞浸润，肉芽肿数量减少但尺寸仍大，围绕死卵，肉芽肿计数显著降低48.05%，直径无显著降低（5.32%）。DAPA单药和联合PZQ治疗显著减轻炎症细胞浸润，显示小尺寸纤维细胞性肉芽肿，围绕部分退化或死卵，肉芽肿计数分别显著降低38.20%和57.27%，直径分别显著降低28.52%和27.66%。

**切割型caspase-3免疫组织化学检测**：未治疗感染小鼠和DMSO处理小鼠肝细胞中切割型caspase-3表达阴性（trace），汇管区和肝细胞间炎症细胞中10-20%阳性（弱1+）；PZQ治疗小鼠肝细胞中15-20%阳性（弱1+），炎症细胞中5-10%阳性（弱1+）；DAPA单药和联合PZQ治疗肝细胞中15-20%阳性（弱1+），炎症细胞中>75%阳性（强3+）。定位观察显示肝细胞中为胞质染色，炎症细胞中为胞质和核染色。

讨论部分，研究人员指出由于杀血吸虫药物缺乏逆转已建立肝脏病理的效力，开发针对血吸虫病肝脏纤维化关键调控因子的新型治疗策略仍是优先方向。该研究首次探讨口服降糖药物DAPA对曼氏血吸虫感染所致肝脏病理的影响。研究证实DAPA不影响PZQ的杀血吸虫效力：联合治疗显著降低成虫负荷和肝脏虫卵负荷，显著增加成熟和死亡虫卵百分比并降低未成熟虫卵百分比。DAPA单药虽未显著降低成虫数，但可能通过免疫调节效应减少肝脏虫卵负荷，增强虫卵排出或排泄。

研究表明PZQ单药未能增加GSH或NO水平，也未显著改善组织病理学改变，甚至出现水样变性，提示其肝毒性。而DAPA联合PZQ显著增加GSH和NO水平，这与其显著降低肝脏虫卵负荷及显著改善组织病理学改变相关。DAPA的抗炎症效应可解释其肝脏病理改善作用：DAPA通过抑制白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-18（IL-18）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）发挥抗炎活性，降低核因子-κB（NF-κB）信号和干扰素-γ（IFN-γ），进而减少肉芽肿直径。DAPA治疗组肝脏和脾脏指数的显著降低可归因于肉芽肿计数显著减少、肝脏虫卵负荷降低、汇管区炎症扩张减轻，以及其抗炎效应改善肝脏灌注。

特别值得关注的是，未经治疗感染小鼠肝细胞中caspase-3表达缺失，这与血吸虫肉芽肿的坏死性特征一致；炎症细胞中弱caspase-3表达可归因于可溶性虫卵抗原可诱导T淋巴细胞凋亡。DAPA治疗诱导受损肝细胞和炎症细胞凋亡，可能与其衰老细胞清除（senolytic）效应相关，因为炎症细胞因子可诱导细胞衰老。同时，DAPA诱导的氧化应激缓解（GSH和NO水平升高）保护了健康肝细胞免遭损伤。因此，DAPA对曼氏血吸虫感染所致肝病的肝脏保护效力部分与凋亡调节相关，且具有caspase-3依赖性。PZQ治疗组炎症细胞中caspase-3弱表达可能反映肝细胞凋亡应答的不完全精细调控，这也部分解释了PZQ相对于DAPA治疗组不完全的肝脏保护效应。

研究人员进一步指出，持续性炎症与树突状细胞、巨噬细胞、单核细胞聚集及炎症介质释放相关，这些介质进一步加剧炎症反应。肝细胞损伤产生的损伤相关分子模式诱发T_H2极化免疫应答，促进HSCs增殖激活及肝脏纤维化。因此，通过治疗干预减少炎症介质释放可减轻炎症和纤维化形成信号通路。适当诱导HSCs凋亡可阻碍ECM沉积，是抗肝脏纤维化的有前景策略。肝脏中NF-κB通过转录上调转化生长因子-β（TGF-β）和TNF-α促进HSCs存活，这些功能作为抗凋亡蛋白。因此，DAPA通过抑制NF-κB信号对HSCs的效应值得进一步研究。

研究结论翻译如下：该研究首次强调了降糖药物DAPA在曼氏血吸虫感染小鼠中的潜在有益效应。DAPA的肝脏保护效应可归因于其针对炎症、氧化应激和凋亡轴的有效性。研究人员的发现强调了DAPA作为PZQ的便捷辅助药物用于缓解血吸虫性肝病的应用价值。建议开展进一步研究以揭示DAPA对血吸虫病诱导肝脏纤维化及其他纤维化增生性疾病模型肝脏保护效应的其他机制。未来研究应纳入血糖水平监测、细胞因子谱分析和体外研究，以更好地阐明DAPA的代谢、肝脏保护和免疫调节效应。