肿瘤诱导小胶质细胞重编程为疾病相关小胶质细胞（DAM）表型促进脑转移

《Advances in Cancer Biology - Metastasis》：Tumor-induced reprogramming of microglia to a DAM phenotype facilitates brain metastasis

　　

摘要

目的
脑转移（BrM）是乳腺癌和肺癌的致死性并发症，其特征为由肿瘤相关巨噬细胞（TAM）主导的免疫抑制性肿瘤微环境。尽管疾病相关小胶质细胞（DAM）已在神经退行性疾病中得到较充分表征，但其在脑转移中的作用仍未被阐明。本研究考察了DAM样表型的出现及其对转移生态位的贡献。

方法
研究人员对来自7个独立脑转移队列（GSE147942、GSE234832、GSE186344、GSE143423、GSE123902、GSE202371、GSE131907）的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据进行了Meta分析，以绘制TAM异质性图谱。为补充这些描述性发现，研究人员采用小鼠（BV2）和人源（HMC3）小胶质细胞与乳腺癌细胞系（4T1/MDA-MB-231）的体外共培养体系，对小胶质细胞表型转变及其相互串扰进行建模。

结果
scRNA-seq分析显示，脑转移生态位内DAM显著富集。该小胶质细胞亚群的特征为稳态标志物下调，同时SPP1、APOE及NF-κB信号通路被强烈诱导。通过CellChat进行的细胞间通讯建模预测，肿瘤来源信号驱动稳态小胶质细胞向该DAM样状态转变，该过程可能由APP-CD74轴和APOE-TREM2轴介导。反向地，CellChat分析提示DAM通过SPP1-CD44串扰与肿瘤细胞发生相互作用。

与上述计算预测一致，体外实验表明，肿瘤条件化小胶质细胞获得DAM样表型，其特征为SPP1、APOE上调以及NF-κB信号激活，并在功能上驱动肿瘤细胞增殖与迁移。对SPP1或NF-κB信号的药理学抑制均可有效减弱这种促迁移效应，并下调肿瘤细胞中APP的表达，提示DAM样小胶质细胞与转移细胞之间存在相互促进的前馈激活环。最后，利用脑转移小鼠模型，研究人员证实SPP1⁺APOE⁺ DAM样小胶质细胞在转移生态位中高度富集，并显著聚集于瘤周微环境。

结论
研究结果表明，脑转移生态位中的小胶质细胞表现出独特的DAM样激活谱，并与促转移特征相关。预测得到的APP-CD74和SPP1-CD44信号轴可作为破坏支持性转移微环境的候选通路，尚需进一步体内功能验证。

该文发表于《Advances in Cancer Biology - Metastasis》，围绕脑转移（BrM）微环境中髓系细胞重塑这一关键问题展开，重点解析了脑驻留免疫细胞小胶质细胞在肿瘤教育下的状态转换。脑转移是乳腺癌和肺腺癌等实体瘤进展中的严重并发症，患者预后差，现有治疗手段有限。既往研究已认识到脑转移灶内存在显著免疫抑制微环境，其中肿瘤相关巨噬细胞（TAM）是主要细胞成分之一，但不同来源髓系细胞的异质性、功能分层及其对转移灶形成的具体贡献仍不充分明确。另一方面，疾病相关小胶质细胞（DAM）作为神经退行性疾病中的代表性活化小胶质细胞状态，已被证明与APOE-TREM2轴、吞噬程序及炎症反应密切相关，但其在脑转移中的存在形式及功能意义尚缺乏系统研究。因此，本研究试图从跨队列单细胞图谱、细胞通讯预测、体外功能实验以及小鼠模型验证多个层面，阐明脑转移中小胶质细胞是否被肿瘤诱导而重编程为DAM样状态，以及这一状态如何促进转移生态位形成。

研究人员首先整合7个独立脑转移单细胞RNA测序（scRNA-seq）队列，包括小鼠231BR脑转移模型与多个人脑转移样本，对脑转移微环境中的细胞组成和TAM异质性进行了再分析。结果显示，与正常脑组织相比，脑转移灶中稳态小胶质细胞显著减少，而多种活化髓系亚群扩增。在小鼠模型中，研究人员定义了多个脑驻留巨噬细胞样簇和骨髓来源巨噬细胞（BMDM）样簇，并观察到一类分泌型小胶质细胞亚群具有典型DAM特征。该亚群失去稳态标志，显著上调Apoe、Spp1、Cst7、Lpl、Axl、Cd9等DAM相关基因，并伴随抗原加工与递呈、干扰素反应以及趋化分泌相关程序增强。这提示脑转移微环境并非仅造成小胶质细胞数量变化，更驱动其发生深度表型重塑。

方法概括：研究主要采用多队列单细胞RNA测序整合分析，样本来源包括GSE147942、GSE234832、GSE186344、GSE143423、GSE123902、GSE202371和GSE131907；使用Seurat、Harmony、AUCell、GSEA、SCENIC、CellChat和Palantir分别完成聚类注释、批次校正、基因特征评分、通路富集、转录因子调控网络、细胞通讯推断及拟时序分析。实验部分采用BV2/HMC3与4T1/MDA-MB-231体外共培养、条件培养基增殖与迁移实验、免疫荧光、Western blot，以及小鼠颈动脉注射脑转移模型和组织多重免疫荧光验证。

在人体脑转移数据中，研究人员进一步证明该DAM样激活模式具有跨物种保守性。人脑转移中的小胶质细胞虽仍保留较BMDM更高的稳态标志表达，但同时明显获得DAM核心程序，上调SPP1、CCL3、CCL4、C1Q复合体亚基以及APOE-TREM2相关分子，并伴随MHC Ⅱ类抗原递呈通路分子的增强表达，如CD74、HLA-DRA、HLA-DP1、HLA-DRB1和HLA-DMA。这一结果说明，脑转移中的小胶质细胞并非单纯炎症激活，而是形成兼具DAM特征与免疫调节功能的特殊状态。

研究结果

Brain metastatic niches contain distinct cellular components
研究人员首先描绘了脑转移生态位的整体细胞图谱。在小鼠231BR模型中，鉴定出小胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、BMDM、成熟树突状细胞、室管膜细胞、血管内皮细胞、周细胞、B细胞和T/NK细胞等主要群体。结果显示，脑转移灶内小胶质细胞比例下降，而其他细胞群扩增，成熟树突状细胞甚至仅见于转移微环境。人脑转移样本中也观察到类似构成，包括肿瘤细胞、TAM、树突状细胞、胶质细胞、血管相关细胞及淋巴细胞等，提示脑转移具有复杂而免疫富集的微环境结构。

Increased DAM and decreased homeostatic microglia characterize the BrM microenvironment
在小鼠髓系细胞重聚类后，研究人员发现脑转移灶中占优势的稳态小胶质细胞群明显耗竭，而不同功能状态的小胶质细胞亚群出现分化。其中一类分泌型小胶质细胞表现出最接近DAM的转录特征，既表达Stage-1 DAM基因，也表达Stage-2 DAM基因，并富集抗原递呈、干扰素应答和趋化功能。该结果表明，脑转移环境推动小胶质细胞由稳态向炎症性、分泌性和促肿瘤性状态转化。

DAM populations exhibit conserved activation patterns in human BrM
在人脑转移样本中，研究人员同样鉴定到具有保守激活特征的DAM群体。该群体最显著的变化包括SPP1、CCL3、CCL4持续上调，补体通路和APOE-TREM2轴活化，以及MHC Ⅱ类分子增强。进一步通路分析显示，DAM在7个独立队列中均与“TNFα via NF-κB signaling”显著相关。转录因子分析提示SPI1（PU.1）、CEBP家族、ETS1/2、KLF9、FLI1，以及REL、FOS、JUNB、IRF1、IRF5、IRF8等共同参与DAM程序调控，表明NF-κB相关炎症网络是该表型的重要调节中枢。

An APOE⁺ BMDM subpopulation acquires a DAM-like phenotype in BrM
除脑驻留小胶质细胞外，研究人员还在人脑转移样本中解析出多种BMDM亚群，包括CD14⁺单核细胞、S1008A⁺巨噬细胞、APOE⁺巨噬细胞、增殖型巨噬细胞、应激型巨噬细胞和MT1H⁺巨噬细胞等。其中APOE⁺巨噬细胞最受关注，其不仅高表达APOE、SPP1、C1Q链及HLA分子，还呈现强烈干扰素应答、趋化和抗原递呈特征。该亚群同时上调APOE-TREM2轴成分、吞噬降解标志、免疫调节分子和神经代谢相关分子，提示一部分浸润性BMDM在脑转移环境中获得了DAM样程序。

DAM-like BMDMs align with a predicted differentiation trajectory in BrM
通过Palantir拟时序分析，研究人员提出DAM样BMDM可能源于APOE⁺ BMDM前体状态，并沿连续轨迹逐步向终末DAM样状态分化。随着拟时序推进，DAM核心评分持续升高，吞噬、血管生成、抗原递呈、干扰素应答和分泌程序逐渐增强。转录水平上，终末状态细胞上调CXCL2、DUSP1/2、NR4A2、KLF6、AREG和NFKBIA等基因。调控网络显示SPI1、MAFB、IRF5和IRF8与这一分化过程密切相关，说明脑转移微环境不仅重塑驻留小胶质细胞，也推动浸润性BMDM向促转移DAM样状态演进。

Tumor-TAM crosstalk establishes an immune-tolerant niche
在细胞通讯层面，CellChat预测肿瘤细胞与TAM之间存在双向关键信号轴：其一为肿瘤来源APP通过CD74作用于TAM，其二为TAM来源SPP1通过CD44作用于肿瘤细胞。与此同时，DAM与DAM样BMDM均高表达APOE，提示APOE-TREM2双向通讯可能帮助维持促肿瘤髓系状态。研究还预测这些细胞可通过LGALS9-CD45和SPP1-CD44等通路参与T细胞耗竭与免疫耐受形成，说明脑转移生态位中的髓系细胞重编程与适应性免疫抑制密切相关。

SPP1⁺ TAMs characterize the brain metastatic niche
SPP1被进一步确认为脑转移中DAM和DAM样巨噬细胞的关键标记。在小鼠模型中，Spp1主要出现在BrM病灶中的DAM群体，而非正常脑组织。整合人类数据后，研究人员发现脑转移灶中的TAM较原发肺腺癌TAM具有更高SPP1表达；4个独立转录组队列的Meta分析也证实，相较原发乳腺癌，脑转移组织中SPP1一致性上调。生存分析虽因脑转移病例数有限而证据初步，但高SPP1表达呈现更短生存趋势。因此，SPP1⁺ TAM可视为脑转移生态位的重要特征，并具有潜在临床意义。

Tumor-educated microglia acquire a pro-tumorigenic DAM phenotype
功能实验部分验证了计算分析的核心推断。BV2和HMC3来源条件培养基可显著促进4T1和MDA-MB-231细胞增殖与迁移。肿瘤细胞刺激后，小胶质细胞出现DAM样重编程，表现为SPP1、APOE上调和NF-κB通路激活，同时SPI1升高、IRF5降低。应用SPP1抑制剂或NF-κB抑制剂均可减弱小胶质细胞诱导的肿瘤迁移，并抑制小胶质细胞DAM样表型，降低APOE、SPP1、SPI1及下游NF-κB活性。值得注意的是，共培养可诱导肿瘤细胞APP表达上调，而该效应可被上述抑制处理逆转，支持DAM样小胶质细胞与肿瘤细胞之间存在相互促进的反馈环。小鼠脑转移模型组织多重免疫荧光进一步证实，SPP1⁺APOE⁺细胞显著富集于EPCAM标记的肿瘤灶周围。

讨论部分总结
本文讨论指出，脑驻留小胶质细胞在脑转移中并非固定发挥抗肿瘤作用，而是在肿瘤教育下发生状态转换，由稳态小胶质细胞转化为SPP1⁺APOE⁺的DAM表型，并通过NF-κB依赖程序参与促转移过程。研究进一步将神经退行性疾病中的APP-CD74、APOE-TREM2等分子模块引入脑转移研究语境，提示肿瘤可能借用与阿尔茨海默病相关的神经炎症调控回路塑造局部免疫抑制环境。与此同时，SPP1作为TAM分泌的促肿瘤糖蛋白，在脑转移中可能通过SPP1-CD44轴同时作用于肿瘤细胞和T细胞，参与侵袭促进与免疫逃逸。文章也指出其局限性，包括泛癌种整合可能掩盖亚型差异、BV2/HMC3细胞系难以完全替代原代人小胶质细胞，以及APOE-TREM2和SPP1-CD44具体功能机制仍需进一步体内验证。

研究结论翻译
研究分析表明，通常与神经退行性疾病相关的疾病相关小胶质细胞（DAM）是脑转移生态位的核心组成部分。该状态以稳态标志物丢失、经典DAM基因（SPP1、APOE）诱导及NF-κB强烈激活为特征。体外实验和计算分析提示，这些“受教育”的小胶质细胞促进肿瘤进展，并与肿瘤来源APP诱导形成相互关联，从而建立一个可能自我维持的反馈环，强化促肿瘤DAM表型。该循环可为脑转移快速临床进展提供一种潜在分子基础。通过靶向NF-κB/SPP1轴，可能打断这种双向串扰，从而为连接神经免疫学与肿瘤学、并突破当前脑转移局部治疗局限提供有前景的治疗策略。