日粮精氨酸(Arg)调控三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)雄性个体不同生命阶段生长性能及睾丸发育的研究

《Animal Nutrition》：Dietary arginine modulates growth performance and testicular development across life stages in male swimming crab (Portunus trituberculatus)

　　

摘要：本研究评估了日粮不同水平精氨酸(Arg)对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)雄性幼体及成体生长性能、睾丸发育及细胞凋亡的影响。研究人员配制了6种等氮(45%粗蛋白)等脂(9%粗脂肪)试验日粮，梯度Arg水平分别为1.89%(对照)、2.27%、2.65%、3.05%、3.43%和3.80%。将180尾初始体重4.35±0.02 g的幼体雄性梭子蟹随机分配至6个处理组(每处理3重复，每重复10尾)，养殖20周。第13周(幼体阶段)每重复取4尾，剩余第20周(成体阶段)每重复取6尾采样。幼体阶段，摄食2.27% Arg日粮组终末体重(FBW)、增重率(PWG)、特定生长率(SGR)和饲料效率(FE)显著高于对照(P<0.05)；3.80% Arg组生长性能最低，而摄食量(FI)呈相反趋势(P<0.001)。血淋巴中2.27% Arg组内皮型一氧化氮合酶(e-NOS)、总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及总抗氧化能力(T-AOC)、还原型谷胱甘肽(GSH)含量最高，均显著高于对照(P<0.05)。肝胰腺中免疫相关基因(mnsod、gsh-px、relish和po)相对表达量较对照上调(P<0.05)；脂质合成(fas、dgat、acc和fad)与分解代谢(cpt-1、fatp和fabp)相关基因显著升高(P<0.05)，B细胞直径较对照显著减小(P<0.001)。成体阶段，2.27%和2.65% Arg组性腺指数(GSI)、睾丸指数(TSI)和输精管指数(VDI)高于其余各组(P<0.05)。血淋巴中2.65% Arg组腺苷酸激酶(AK)、神经元型一氧化氮合酶(n-NOS)活性及一氧化氮(NO)含量显著升高(P<0.05)，血氨(BA)含量较对照显著降低(P=0.007)。与对照相比，2.65% Arg组睾丸中Arg代谢(odc1、creatinase、nadh6、sms和nnos)、精子发生(iag、dsx和soxe)及蛋白质合成(tor)相关基因相对表达量显著升高(P<0.05)；抗凋亡基因(bcl2)相对表达上调，BAX/BCL-2及P-JNK/JNK比值降低，凋亡细胞比例及活性氧(ROS)平均荧光强度下降(P<0.05)。综上，幼体和成体雄性三疣梭子蟹最适日粮Arg需求量分别估算为2.04%和2.46%；2.27% Arg最大程度增强免疫功能，2.65% Arg可促进成体雄蟹Arg代谢、睾丸发育并减少细胞凋亡。

论文解读：日粮精氨酸(Arg)调控三疣梭子蟹雄性个体不同生命阶段生长性能及睾丸发育的研究

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)是我国重要的海水养殖甲壳动物，当前养殖主要依赖天然饵料，营养需求研究滞后，尤其缺乏针对雄性个体不同发育阶段的精细化营养配方依据。精氨酸(Arginine, Arg)作为必需氨基酸，不仅是蛋白质合成的原料，还可作为一氧化氮(NO)、多胺(Polyamines)、肌酸等生物活性分子的前体，参与免疫调节、抗氧化及生殖发育过程。已有研究多聚焦于对十足类幼体或雌体卵巢发育的影响，关于Arg对雄性甲壳动物幼体—成体连续生活阶段生长及睾丸发育的系统性研究尚属空白。本研究由宁波大学水产动物营养实验室开展，通过设置梯度Arg日粮，探究其对雄性三疣梭子蟹幼体(13周)及成体(20周)生长性能、抗氧化免疫、肝胰腺脂质代谢、睾丸精子发生、细胞凋亡及相关基因表达的调控效应，以确定不同阶段最适Arg需求量，为雄性梭子蟹阶段性配合饲料开发提供理论支撑。论文发表于《Animal Nutrition》。

主要关键技术方法

研究人员以初始体重4.35±0.02 g健康幼体雄性三疣梭子蟹为样本队列，配制6种等氮(45%粗蛋白)等脂(9%粗脂肪)日粮(Arg实测值1.89%、2.27%、2.65%、3.05%、3.43%、3.80%)，单只分养于循环水养殖系统(RAS)中养殖20周。分别于第13周(幼体期)和第20周(成体期)取样，测定生长与形体指标；血淋巴制备上清测定e-NOS、n-NOS、精氨酸激酶(Arg Kinase, AK)、T-SOD、CAT、T-AOC、GSH、丙二醛(MDA)、NO、血氨(BA)等生化参数；取肝胰腺与睾丸组织进行苏木精—伊红(H&E)及油红O(Oil Red O)染色做组织形态学观察；采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测肝胰腺抗氧化/免疫基因、脂质合成与分解代谢基因及睾丸Arg代谢、精子发生、mTOR信号通路、凋亡相关基因的相对表达量(以β-actin为内参，2^-ΔΔCt法计算)；睾丸组织经蛋白提取后行Western Blot检测BCL-2、BAX、JNK及磷酸化JNK(P-JNK)蛋白水平；分离睾丸线粒体，利用流式细胞术检测线粒体凋亡率及活性氧(ROS)水平；所有数据经正态性与方差齐性检验后，采用单因素方差分析(One-way ANOVA)及Tukey多重比较，并通过双折线回归模型(Broken-line Regression)估算最适Arg需求量。

研究结果

3.1. Growth performance in juvenile stage(幼体阶段生长性能)

通过对13周养殖后生长参数的测定发现，2.27% Arg组终末体重(FBW)、增重率(PWG)、特定生长率(SGR)及饲料效率(FE)显著高于对照组(P<0.05)，过高Arg(3.80%)则抑制生长；摄食量(FI)随Arg水平升高呈先降后升趋势。以PWG为因变量做双折线回归，得出幼体雄性梭子蟹最适日粮Arg需求量为2.04%。

3.2. Hemolymph biochemical indicators in the juvenile stage(幼体阶段血淋巴生化指标)

2.27% Arg组血淋巴e-NOS活性、T-SOD、CAT、T-AOC及GSH含量最高且显著高于对照(P<0.05)，MDA含量显著降低；NO随日粮Arg升高而增加，血氨(BA)在2.65% Arg组最低；n-NOS与AK活性组间无显著差异。表明适量Arg可增强幼体抗氧化与Arg—NO代谢平衡能力。

3.3. Hepatopancreatic histomorphometric indexes in juvenile stage(幼体阶段肝胰腺组织形态学指标)

H&E染色显示3.43%和3.80% Arg组肝胰腺B细胞肿胀，2.27%和2.65% Arg组B细胞直径较对照显著减小(P<0.001)；油红O染色表明肝胰腺脂滴相对面积随Arg升高锐减。提示适量Arg减轻肝胰腺脂质蓄积、维持细胞结构完整，过量则引起细胞水肿。

3.4. Expression of genes related to antioxidant and oxidative stress in juvenile stage(幼体阶段抗氧化及氧化应激相关基因表达)

2.27% Arg组肝胰腺mnsod、gsh-px、relish及po相对表达量较对照显著上调(P<0.05)，cat在2.65% Arg组下调；3.05% Arg组cat、gsh-px、po上调。表明适量Arg激活肝胰腺抗氧化及免疫相关基因转录。

3.5. Gene expression associated with lipid metabolism during the juvenile stage(幼体阶段脂质代谢相关基因表达)

2.27% Arg组肝胰腺脂质合成基因(fas、dgat、acc、fad)与分解代谢基因(cpt-1、fatp、fabp)相对表达均较对照显著升高(P<0.05)，说明适量Arg促进脂质周转与动态代谢平衡。

3.6. Morphological indicators in the adult stage(成体阶段形体指标)

养殖20周后，2.27%和2.65% Arg组性腺指数(GSI)、睾丸指数(TSI)、输精管指数(VDI)显著高于对照(P<0.05)，肝胰腺指数(HSI)无差异。以GSI做双折线回归得出成体雄性梭子蟹最适日粮Arg需求量为2.46%。

3.7. Hemolymph biochemical indicators in the adult stage(成体阶段血淋巴生化指标)

2.65% Arg组血淋巴AK与n-NOS活性及NO含量显著高于对照(P<0.05或P=0.008)，BA含量显著降低(P<0.001)；e-NOS活性组间无差异。表明成体期适宜Arg激活n-NOS—NO通路并改善氮代谢。

3.8. Histological observation in testis and vas deferens in adult stage(成体阶段睾丸及输精管组织学观察)

2.65% Arg组睾丸中生精小管内成熟精子(S)及精子细胞(Spermatid, SPD)比例最高，输精管内精子密度最大；超过此水平后生精阻滞于精原细胞(Spermatogonium, SPG)和初级精母细胞(Primary Spermatocyte, PC)；3.80% Arg组睾丸退化以SPG和PC为主。提示2.65% Arg最利于成体精子发生与输精管充盈。

3.9. Expression of genes involved in arginine metabolism in adult stage(成体阶段精氨酸代谢相关基因表达)

2.65% Arg组肝胰腺与睾丸中鸟氨酸脱羧酶1(ornithine decarboxylase 1, odc1)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基6(mitochondrial NADH dehydrogenase subunit 6, nadh6)、神经元型一氧化氮合酶(nnNOS/nnos)相对表达较对照上调(P<0.05)；睾丸中精脒合成酶(spermine synthase, sms)、肌酸酶(creatinase)亦上调。说明适宜Arg促进多胺、NO及肌酸合成相关基因表达。

3.10. Gene expression related to protein synthesis and spermatogenesis in the testes of adult crabs(成体阶段睾丸蛋白质合成与精子发生相关基因表达)

2.65% Arg组睾丸中mTOR(target of rapamycin, tor)、胰岛素样雄腺激素(insulin-like androgenic gland hormone, iag)、性别决定基因doublesex(dsx)、SOX E族基因(soxe)相对表达显著上调(P<0.05)，激活IR—mTOR信号级联，提示Arg通过soxe—dsx—iag轴促进睾丸分化与精子发生。

3.11. Apoptosis and ROS in adult crab testes(成体阶段睾丸凋亡及ROS检测)

2.65% Arg组睾丸抗凋亡基因bcl2相对表达最高，促凋亡caspase-8在≥3.05% Arg组升高；蛋白水平BAX/BCL-2及P-JNK/JNK比值在2.65% Arg组降低(P<0.05)；流式细胞术显示2.27%~3.05% Arg组线粒体凋亡率及ROS荧光强度低于对照，3.80% Arg组凋亡率升高。表明适量Arg抑制线粒体凋亡途径并降低ROS，过量则诱导凋亡。

讨论与结论总结

讨论指出幼体与成体雄性梭子蟹对Arg的营养生理需求存在阶段性差异：幼体期Arg主要用于支持体组织生长、增强血淋巴抗氧化酶活性(e-NOS、T-SOD、CAT、T-AOC、GSH)及上调肝胰腺免疫抗氧化基因(mnsod、gsh-px、relish、po)，并通过NO通路协调脂质合成与分解基因共上调，减小B细胞直径、降低脂滴蓄积，维持肝胰腺健康；成体期Arg代谢转向多胺(odc1、sms)、肌酸(creatinase)及n-NOS—NO通路，激活soxe—dsx—iag内分泌轴及下游IR—mTOR信号，促进精原细胞向成熟精子分化，提升GSI、TSI及VDI，同时上调bcl2、降低BAX/BCL-2与P-JNK/JNK比值、抑制线粒体ROS介导的凋亡。过高Arg(3.80%)引起生长抑制、肝胰腺B细胞肿胀及睾丸生精阻滞甚至退化，并激活caspase-8依赖凋亡途径。

结论：基于生长与性腺发育指标，幼体雄性三疣梭子蟹最适日粮Arg需求量为2.04%(推荐添加水平2.27%)，成体雄性最适需求量为2.46%(推荐添加水平2.65%)；2.27% Arg最大程度增强幼体免疫与抗氧化功能，2.65% Arg促进成体Arg代谢、睾丸发育并抑制生精细胞凋亡。本研究为雄性三疣梭子蟹分阶段精准营养配方制定提供了重要实验依据。