单次注射重组促卵泡激素可促进部分幼年鲻鱼（*Mugil cephalus*）的精子发生起始

《Aquaculture Reports》：A single recombinant follicle stimulating hormone injection promotes spermatogenesis onset in a proportion of juvenile flathead grey mullet Mugil cephalus

　　

重组促性腺激素已被证明能有效克服成年圈养鲻鱼（*Mugil cephalus*）中观察到的生殖功能障碍。本研究旨在评估重组促卵泡激素（rFsh）在该物种中诱导早熟青春期的有效性，同时提高研究人员对Fsh在精原细胞自我更新、增殖、向精子发生进展以及睾丸凋亡（apoptosis）中作用的理解。幼鱼（338.1±47.1 g）被分配到三组：未处理对照组（C-0组；N=9）、注射盐水并在注射后7天采样的对照组（C-7组；N=9），以及接受单次鲻鱼特异性rFsh注射（12 μg kg^-1）并在注射后7天采样的处理组（rFsh-T组；N=10）。与对照组相比，rFsh-T组中有4个个体表现出更高的性腺指数（GSI）、扩大的生精小管（seminiferous tubules）以及晚期精子发生的组织学特征。这些响应者表现出分裂中的未分化精原细胞（undifferentiated spermatogonia）密度降低，定向精原细胞（committed spermatogonia）密度增加，血浆11-酮睾酮（11-KT）水平升高，以及更高的11-KT/17β-雌二醇（E2）比值。除了一条rFsh响应的鱼表现出散在的凋亡精原细胞和支持细胞（Sertoli cells）外，所有组的凋亡均可忽略不计。这些结果表明，rFsh通过刺激11-KT分泌和增加11-KT/E2比值，成功启动了40%处理鱼的精子发生，从而促进了精原细胞向减数分裂增殖。最后，该研究证明未分化精原细胞在幼年鲻鱼中不受凋亡的显著影响，有助于深入了解季节性繁殖鱼类睾丸凋亡模式。

**论文解读文章**

**研究背景**
鲻鱼（*Mugil cephalus*）是水产养殖中的重要物种，但成年圈养个体常出现严重生殖功能障碍，表现为雌鱼卵母细胞停滞于初级生长阶段，雄鱼缺乏可挤出精液。重组促性腺激素（rGths）已被证明能有效克服这些障碍，例如通过两种重组促性腺激素（rFsh和rLh）的序贯给药诱导产卵和排精。然而，利用rGths加速幼鱼性成熟（即提前青春期）的研究效果不一。促卵泡激素（Fsh）在鱼类精子发生起始阶段起核心调节作用，尤其是精原细胞的有丝分裂（包括自我更新和定向分化进入减数分裂）和类固醇生成调控。但Fsh在精原细胞自我更新与分化之间的平衡机制、以及凋亡在幼鱼睾丸中的作用仍待阐明。本研究旨在评估单次注射物种特异性重组Fsh（rFsh）能否诱导幼年鲻鱼早期精子发生，并探讨其与性类固醇、精原细胞增殖及凋亡的关系，为加速水产养殖生产周期提供依据。

**主要关键技术方法**
研究人员使用了来自IRTA（西班牙La Rápita）的2020年野生鲻鱼苗培育的幼鱼（体重338.1±47.1 g）。实验设置三个组：未处理对照组（C-0，n=9）、注射生理盐水7天后采样对照组（C-7，n=9）和单次注射12 μg kg^-1 rFsh后7天采样处理组（rFsh-T，n=10）。主要技术方法包括：①通过酶免疫测定法（EIA）检测血浆11-酮睾酮（11-KT）、17β-雌二醇（E2）和皮质醇浓度；②组织学（苏木精-伊红染色）观察性腺指数（GSI）和生精小管结构；③免疫组化检测Nanos2（精原干细胞标志物）、增殖细胞核抗原（PCNA，细胞增殖标志）和Caspase-3（早期凋亡标志）；④TUNEL法检测晚期凋亡的DNA断裂。通过显微图像分析测量生精小管直径及抗PCNA阳性未分化/分化精原细胞密度。

**研究结果**
**3.1 性腺指数与组织学分析**
通过比较各组GSI和生精小管组织学结构，发现rFsh-T组的平均GSI显著高于C-0组（P<0.05），但与C-7组无显著差异。然而，rFsh-T组中4个个体（40%）表现为响应者：其生精小管显著增大，出现定向精原细胞和初级精母细胞，而对照和其余6个非响应者仅含Nanos2阳性未分化精原细胞，无精子发生迹象。这表明单次rFsh注射可诱导部分幼鱼精子发生启动，但个体响应差异明显。

**3.2 免疫组化与凋亡检测**
抗PCNA免疫染色结果显示：与对照组相比，rFsh-T组（尤其是响应者）中单个未分化精原细胞（PCNA阳性）密度显著降低（P<0.05），而定向分化精原细胞（PCNA阳性）密度则增加约百倍（P<0.05），表明rFsh促进了精原细胞从自我更新向分化增殖的转变。TUNEL和抗Caspase-3检测显示，所有组中凋亡均极低，仅一条rFsh响应鱼的睾丸中出现散在凋亡精原细胞和支持细胞。这说明未分化精原细胞在幼鱼中不受明显凋亡影响，与季节性繁殖鱼类的模式一致。

**3.3 类固醇激素血浆浓度**
血浆激素测定揭示了响应者的内分泌特征：rFsh-T组整体11-KT水平显著高于两对照组（P<0.05），且响应者11-KT浓度又显著高于非响应者（P<0.05）。E2水平在C-7组和响应者中显著低于C-0组（P<0.05）。11-KT/E2比值在响应者中显著高于C-0和C-7组（P<0.01），尽管与非响应者差异不显著。皮质醇水平在C-0组最高，C-7和rFsh-T组均显著降低（P<0.05），表明实验处理应激水平随时间下降。这些结果说明，rFsh通过上调11-KT合成并降低E2，改变类固醇平衡（即提高11-KT/E2比值），从而驱动精原细胞向减数分裂分化，而非促进自我更新。

**讨论与结论**
讨论部分指出：单次注射12 μg kg^-1 rFsh虽然引起所有处理鱼内分泌激活（11-KT升高），但仅40%的幼鱼出现组织学可检的精子发生，表明睾丸功能性成熟程度（即生精细胞和体细胞对激素信号的响应能力）存在个体差异。与成年鲻鱼（所有个体均响应并完成排精）不同，幼鱼响应率低说明需要优化方案（如多次注射及根据年龄/大小筛选响应预测指标）。关于激素机制，研究认为Fsh通过刺激莱迪希细胞分泌11-KT，并降低E2，使得11-KT/E2比值升高，从而促进定向精原细胞增殖并减少未分化精原细胞数量。这一发现与文献中Fsh同时促进自我更新和分化的结论表面矛盾，可能归因于高剂量或采样时间点导致自我更新信号被分化信号压制，暗示长期rFsh治疗可能导致精原细胞耗竭甚至不育。凋亡方面，未分化精原细胞几乎不受凋亡影响，这与精原干细胞保护机制一致，而仅在一条响应鱼中见少量凋亡，支持了前期提出的鱼类生精凋亡模型：在首次精子发生尝试（即早熟启动）中，若促性腺激素不足以支持减数分裂完成，分化精原细胞发生凋亡；而本研究中幼鱼未出现广泛凋亡，表明rFsh提供的激素水平足以支持精子发生初步完成。结论部分翻译如下：本研究突出了rFsh在水产养殖中加速性成熟的潜力，同时强调了性腺响应性的个体差异。对于水产应用，观察到的异质性响应表明可能需要优化处理方案或重复给药以实现一致效果。尽管部分响应，但成功在40%幼鱼中诱导精子发生证明了rFsh促进幼年鲻鱼性成熟的潜力，并为未来大规模试验（涉及两种重组促性腺激素rFsh和rLh序贯给药）奠定了基础。这种方法可显著缩短世代时间、加速遗传选择计划。最后，研究表明早期精原细胞在鲻鱼幼鱼中不受凋亡影响，且rFsh促进精原细胞向减数分裂进展而非自我更新，从而有助于更好地理解季节性繁殖鱼类的精子发生。