冷大气等离子体选择性诱导前列腺癌细胞毒性并与氧化应激相关

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Cold atmospheric plasma selectively induces toxicity of prostate cancer cells associated with oxidative stress

　　

冷大气等离子体（CAP）是一种在大气压下产生的电离气体，其中重粒子（离子、分子、原子）的温度保持在接近室温。CAP产生复杂的活性氧和活性氮物种（RONS）混合物。最近的研究已证明其能够在体外和体内诱导多种癌细胞系细胞死亡。有趣的是，非肿瘤细胞似乎相对较少受到CAP处理的影响，这一现象被称为CAP选择性。本研究旨在探究介质阻挡放电（DBD）产生的CAP喷射在人前列腺细胞中的差异选择性，比较前列腺癌PC3细胞与非肿瘤RWPE-1细胞。研究人员将细胞暴露于CAP处理5-60秒，并在处理后4小时和24小时评估细胞活力（MTS assay）、细胞膜完整性（碘化丙啶，PI染色）、形态学（相差显微镜）、细胞内ROS产生（DHE染色）以及抗氧化酶活性（超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶（GPx））。CAP暴露导致PC3细胞活力呈时间依赖性下降，在暴露≥30秒时观察到显著的活力影响，而RWPE-1细胞显示出相对抵抗。PI染色证实PC3细胞比RWPE-1细胞有更大的质膜损伤。形态学改变如细胞变圆和脱落，在PC3细胞中比RWPE-1更明显。CAP显著增加PC3细胞内的ROS水平（60秒后高达73% DHE阳性），并伴有SOD上调和过氧化氢酶及GPx活性降低。相比之下，RWPE-1细胞表现出较不明显的氧化反应，并且抗氧化酶活性得以保持。总之，这些结果证明了在实验条件下前列腺癌细胞与非肿瘤细胞对CAP处理的不同敏感性，与细胞氧化还原状态的改变相关。这些发现表明，DBD产生的CAP可能代表一种有前景的前列腺癌靶向治疗方法。

冷大气等离子体（cold atmospheric plasma, CAP）是一种在大气压下产生的低温电离气体，其重粒子温度接近室温，同时产生多种活性氧和活性氮物种（reactive oxygen and nitrogen species, RONS）。近年来，CAP在肿瘤治疗领域受到广泛关注，研究显示其能够在体外和体内诱导多种癌细胞死亡，而非肿瘤细胞相对不敏感，此现象称为CAP选择性。然而，CAP选择性细胞毒性的分子机制尚未完全阐明，特别是氧化应激在其中所起的作用仍有待深入研究。前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤，现有治疗手段对雄激素非依赖性、高度肿瘤原性的PC3细胞效果有限。因此，研究人员旨在利用介质阻挡放电（dielectric barrier discharge, DBD）产生的CAP处理前列腺癌细胞（PC3）和正常前列腺上皮细胞（RWPE-1），探讨其选择性杀伤作用是否与氧化应激相关。本研究选用人前列腺癌PC3细胞和人非肿瘤性前列腺上皮RWPE-1细胞为模型，暴露于DBD-CAP不同时间（5-60秒），在4小时和24小时后评估细胞活力、质膜完整性、细胞形态、细胞内活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平及抗氧化酶活性。研究结论：CAP对PC3细胞表现出选择性细胞毒性，且与氧化应激失衡密切相关。重要意义：该研究揭示CAP可通过诱导氧化应激选择性杀伤前列腺癌细胞，为开发非侵入性前列腺癌靶向治疗提供了新策略。本论文发表于《Biochemical and Biophysical Research Communications》。

主要关键技术方法包括：细胞培养（PC3和RWPE-1细胞均购自美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection, ATCC）），采用MTS法检测细胞活力，用碘化丙啶（propidium iodide, PI）染色结合流式细胞术评估质膜完整性，通过相差显微镜观察细胞形态变化，利用二氢乙啶（dihydroethidium, DHE）染色流式检测细胞内ROS水平，并使用分光光度法分别测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GPx）的活性。所有实验均进行三次独立重复，数据以均值±标准误表示，采用单因素或双因素方差分析及Dunnett多重比较检验进行统计学分析。

**3.1 CAP induces cell death**：通过MTS法检测发现，CAP暴露导致PC3细胞活力呈时间依赖性降低，暴露30秒时出现显著下降，ET₅₀为20秒；而RWPE-1细胞直到60秒才出现轻度降低，ET₅₀>60秒，表现出相对抵抗。PI染色结果显示，PC3细胞中PI阳性比例随暴露时间显著增加，60秒时达67%，表明质膜损伤严重；RWPE-1细胞变化有限。相差显微镜观察到PC3细胞在处理30秒和60秒后出现细胞变圆、脱落等形态变化，而RWPE-1细胞形态基本保持不变。这些结果表明CAP选择性诱导PC3细胞死亡。

**3.2 CAP induces oxidative stress**：DHE染色流式检测显示，CAP处理30秒和60秒后，PC3细胞内ROS阳性率分别升高至41%和73%，而RWPE-1细胞仅分别升至14%和26%。抗氧化酶活性测定发现，PC3细胞中SOD活性在4小时时显著上调（30秒和60秒分别升高至116%和127%），但过氧化氢酶活性显著下降至约43%，GPx活性也降至约54%；而RWPE-1细胞中三种酶活性均未出现显著变化。24小时后，PC3细胞所有抗氧化酶活性均下降，表明氧化应激持续存在；RWPE-1细胞则部分恢复。因此，CAP通过诱导PC3细胞内ROS大量积累并破坏抗氧化酶系统平衡（高SOD、低过氧化氢酶和GPx），导致H₂O₂蓄积和氧化损伤，从而实现选择性毒性。

在讨论部分，研究人员指出，CAP选择性细胞毒性与氧化应激失衡密切相关。PC3细胞因基础氧化应激水平高，更易受到额外ROS攻击；CAP产生的RONS（如H₂O₂）通过抑制过氧化氢酶和GPx活性，导致H₂O₂累积。同时，SOD初期代偿性上调可能进一步促进H₂O₂生成。尽管细胞内SOD活性升高，但过氧化氢酶和GPx活性受抑，造成氧化还原失衡，最终导致细胞损伤。相比之下，RWPE-1细胞抗氧化防御能力较强，能维持酶活性稳定，从而抵抗CAP毒性。此外，讨论还提到水通道蛋白（aquaporin 3, AQP3）可能参与H₂O₂跨膜转运，以及Nrf2/MAPK等信号通路的作用，但本实验未直接验证。研究结论部分可翻译为：总之，本研究表明，DBD产生的CAP在实验条件下选择性地诱导前列腺癌PC3细胞系产生差异敏感性，而几乎不影响非肿瘤性RWPE-1细胞。这种差异敏感性与氧化应激有关：CAP迅速提高前列腺癌细胞中ROS水平，并触发早期适应性SOD上调；然而，过氧化氢酶和GPx活性被抑制，导致抗氧化防御失衡和H₂O₂积累，这很可能导致氧化损伤和细胞死亡。作为一种治疗策略，CAP代表了一种新型基于氧化还原的抗癌方法，用于靶向如PC3等侵袭性强且治疗耐药的前列腺癌细胞。为加强这些发现，未来研究应开展体内外实验，特别关注安全性和选择性；同时，探索使用药物调节氧化还原平衡的组合疗法以及免疫靶向治疗。此外，还需进一步研究H₂O₂通过水通道蛋白（AQP3）的运输及Nrf2或MAPK等氧化还原敏感信号通路的作用，以更好阐明CAP效应的分子机制。