《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Integrated Bioinformatics and Ex-Vivo Evaluation of Resveratrol in Modulating Oxidative Stress and Neutrophil Extracellular Traps in COPD
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安舒·库马尔（Anshu Kumar）| 萨尔维吉特·达斯（Sarvjeet Das）| 纳宾·科伊拉拉（Nabin Koirala）| 德布纳拉扬·卡图阿（Debnarayan Khatua）| 拉维什·克沙特里亚（Ravish Kshatriya）| 阿努帕姆·乔蒂（Anup
安舒·库马尔（Anshu Kumar）| 萨尔维吉特·达斯（Sarvjeet Das）| 纳宾·科伊拉拉（Nabin Koirala）| 德布纳拉扬·卡图阿（Debnarayan Khatua）| 拉维什·克沙特里亚（Ravish Kshatriya）| 阿努帕姆·乔蒂（Anupam Jyoti）
印度古吉拉特邦瓦多达拉（Vadodara）瓦戈迪亚（Waghodia）帕鲁尔大学（Parul University）应用科学学院生命科学系，邮编391760
摘要
背景
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是一种异质性疾病，其特征是持续的炎症和氧化应激介导的病理机制。识别针对患者特定氧化损伤的药物靶点至关重要。白藜芦醇因其抗氧化和抗炎特性而成为一种有前景的治疗候选物。本研究旨在确定其靶点并评估其在COPD中由中性粒细胞驱动的氧化应激中的治疗效果。
方法
使用GSE11952和GSE232805数据集进行了生物信息学分析。通过分子对接验证了排名靠前的枢纽基因作为候选药物。从健康志愿者和COPD患者中分离出外周血中性粒细胞，并在体外香烟烟雾（CSE）暴露下，加入或不加入白藜芦醇，然后进行细菌或PMA处理，随后进行基于Python的统计和探索性数据分析。我们进一步评估了白藜芦醇对活性氧（ROS）生成和中性粒细胞胞外陷阱（NETs）形成的影响。
结果
三种中心性算法中共同识别的排名靠前的枢纽基因是FN1、CD44、ITGA5和THBS1，它们在细胞外基质-受体相互作用、晚期糖基化终产物-受体、缺氧诱导因子1、细胞因子信号传导和铁死亡途径中发挥作用。分子对接结果显示白藜芦醇与ITGA5的结合亲和力最高（-7.4 kcal/mol）。体外定量分析显示，白藜芦醇显著降低了健康和中性粒细胞在CSE条件下的细菌诱导的ROS水平。此外，它还显著减少了COPD患者中性粒细胞在PMA刺激下的ROS生成和NETs形成。
结论
白藜芦醇在调节COPD的氧化应激方面表现出显著的抗氧化作用。综合生物信息学和体外实验表明，ITGA5可能是白藜芦醇抑制COPD中ROS生成和NETs形成的候选靶点。
引言
慢性阻塞性肺疾病（COPD）是全球健康负担之一，是导致超过4亿人患病的第三大原因，主要影响低收入和中等收入国家[1]。COPD的特点是持续的气流受限、慢性炎症和反复的下呼吸道感染，并且随着年龄的增长逐渐恶化[2]。其潜在的风险因素包括长期接触烟草烟雾、刺激物、农村地区的家庭烟雾、职业性粉尘和烟雾，所有这些都会导致氧化应激和炎症[3]。
目前的治疗方法包括使用类固醇和支气管扩张剂，这些方法只能缓解症状并帮助清除气道分泌物。然而，它们在针对氧化应激、肺气肿进展和持续的气道重塑方面效果有限，也无法解决疾病进展中的肺损伤和修复机制[4]。将新型药物转化为临床实践的主要瓶颈包括遗传易感性[5]、环境因素[6]、依赖“一刀切”方法的治疗方式[7]、患者治疗反应和病情严重程度的差异[8]。此外，还需要识别参与COPD发病机制的具体可靶向蛋白质和通路，以及用于个性化治疗的药物[9]。
中性粒细胞是关键的先天免疫细胞，它们首先到达炎症部位，并由于异常迁移而积聚，从而加剧COPD中的氧化应激。COPD中的中性粒细胞优势与持续的低度全身炎症、C反应蛋白（CRP）水平升高、肺功能下降以及由于活性氧（ROS）和一氧化氮（NO）产生增加导致的气道上皮组织损伤有关[10]。COPD的气道通过由组蛋白和颗粒蛋白组成的中性粒细胞胞外陷阱（NETs）表现出抗菌防御作用[11]。虽然在急性感染中有益，但NETs的过度积累和持续存在会加重组织损伤并促进疾病进展[12]、[13]。
吸烟引起的微生物失调会持续气道炎症和损伤[14]。香烟烟雾暴露（CSE）通过增加氧化应激来增强病原体的毒力，使气道更容易受到难治性疾病的侵袭[15]、[16]、[17]。微生物组研究显示微生物群落失衡、NETs形成增加、细菌吞噬作用受损，所有这些都与疾病严重程度和频繁的急性加重有关[18]。
整合素-α5（ITGA5）是参与细胞间相互作用、纤维连接蛋白依赖性粘附、气道细胞外基质重塑和炎症反应的关键基因[19]、[20]。在心房颤动-COPD共病的研究中，ITGA5已被确定为枢纽基因[21]。值得注意的是，吸烟者的气道上皮中ITGA5表达通常较低[22]。特别是在COPD背景下，中性粒细胞与细胞外基质相互作用的ITGA5的作用仍很大程度上未被探索。本研究提供了强有力的体外数据和支持，为未来的相关研究提供了初步验证。
白藜芦醇（3,5,4′-三羟基芪）是一种天然存在于红葡萄酒提取物、桑葚、葡萄皮以及Polygonum cuspidatum（日本虎杖）等植物中的植物多酚。白藜芦醇的广泛应用归功于其强大的抗氧化、抗炎、抗肿瘤和抗衰老特性[23]、[24]。在COPD中，白藜芦醇通过SIRT1激活增强PGC-1α活性[25]，从而上调AMPK和HDAC2的表达[26]。白藜芦醇处理恢复了Nrf2/ARE的表达，显示出抗氧化、抗炎和抗凋亡作用，并减轻了肺损伤[27]、[28]。白藜芦醇通过诱导谷胱甘肽合成来调节Nrf2通路，保护人类肺上皮细胞，从而逆转CSE引起的氧化应激[29]。Nrf2通路在衰老和细胞衰老中起着关键作用，Franco等人已经证实了白藜芦醇对其的调节作用[30]。砷化物导致的小鼠肺和支气管上皮细胞中occludin mRNA和蛋白质的表达减少被NAC和白藜芦醇完全逆转或恢复[31]。白藜芦醇在癌症管理中具有多种作用，通过靶向miRNAs或lncRNAs或与siRNAs联合使用，抑制肿瘤转移并促进细胞衰老[32]。白藜芦醇及其在COPD患者中性粒细胞中的抗氧化作用，特别是在体外 CSE和细菌刺激下的作用，仍需进一步探索。
计算数据分析已成为处理复杂生物数据集的重要工具，能够实现实验响应的可重复预处理、可视化和统计解释。在COPD研究中，这些方法有助于比较不同刺激和治疗条件下的异质性炎症反应。在本研究中，计算分析用于量化中性粒细胞在细菌刺激和CSE暴露下的ROS反应，从而支持将白藜芦醇作为潜在治疗候选物的评估。
我们假设通过综合体内分析识别和筛选枢纽基因将有助于确定潜在靶点，并找到可能有助于减轻COPD患者和健康个体中性粒细胞在体外条件下细菌和CSE刺激引起的ROS和NETs形成的候选药物。我们的目标是确定COPD中性粒细胞患者的潜在治疗靶点，并研究该药物对细菌和CSE刺激的氧化应激的影响。在本研究中，我们从与香烟烟雾引起的气道上皮损伤相关的数据集中识别了关键枢纽基因Nrf2和NETs。基于大量文献支持中性粒细胞炎症在肺气道中的作用、Nrf2激活、香烟烟雾引起的氧化应激、气道上皮损伤或上皮屏障功能障碍以及NETs，我们旨在识别和排序排名靠前的枢纽基因，确定候选药物，进行体内分析，然后在体外条件下验证该药物。我们使用COPD和健康个体的中性粒细胞启动实验验证了白藜芦醇的效果，并研究了其对减轻中性粒细胞驱动的氧化应激和NETs形成的作用。
部分摘录
GEO2R
GSE11952和GSE232805的火山图和平均差异图显示在图2A-2D中。它们基于GEO2R平台上设定的log2FC阈值1.50和调整后的P值<0.05，展示了上调和下调的DEGs的分布。GSE11952显示了吸烟者与非吸烟者组之间的DEGs（图2-A和2-B），GSE232805显示了处理组与未处理组之间的DEGs（图2-C和2-D）。
维恩图分析
保持log2倍数变化阈值为1.50，未发现两组之间的共同基因
讨论
吸烟者气道中的中性粒细胞优势可能导致对感染或病原体刺激的炎症反应增强[10]。COPD患者常在下呼吸道出现全身性炎症，这会损害黏液纤毛清除功能并导致气流阻塞[42]。COPD患者中氧化应激的增加以及NETs的持续存在丰富了气道内的特定微生物群[18]、[43]。随后，疾病会进一步进展
CRediT作者贡献声明
安舒·库马尔（Anshu Kumar）：撰写 – 审稿与编辑、原始草稿撰写、方法学研究、调查、正式分析。萨尔维吉特·达斯（Sarvjeet Das）：原始草稿撰写、方法学研究、调查、正式分析。纳宾·科伊拉拉（Nabin Koirala）：调查、数据管理。德布纳拉扬·卡图阿（Debnarayan Khatua）：撰写 – 审稿与编辑、调查。拉维什·克沙特里亚（Ravish Kshatriya）：调查、正式分析。阿努帕姆·乔蒂（Anupam Jyoti）：撰写 – 审稿与编辑、验证、监督、调查、资金获取、正式分析、概念构思
数据可用性声明
本研究的数据将在合理请求下由相应作者提供。
资金信息
Parul大学研究与发展部门的RDC/IMSL/163>的阿努帕姆·乔蒂（Anupam Jyoti提供的财务支持。
致谢
安舒·库马尔感谢古吉拉特邦政府教育部门提供的优质研究发展计划（SHODH）奖学金（学生参考编号：202401599）。也非常感谢Parul大学的支持。
