β-谷甾醇通过抑制铁死亡（ferroptosis）机制，保护人类软骨细胞免受IL-1β诱导的损伤

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：β-Sitosterol protects human chondrocytes from IL-1β -induced damage by inhibiting ferroptosis

　　

作者：张雷 | 孔晓川 | 郭红 | 郑银峰 | 张雷

首都医科大学北京朝阳医院骨科，中国北京100020

摘要

目的

研究β-谷甾醇对白细胞介素（IL）-1β诱导的软骨细胞损伤的影响及其相关机制。

方法

通过用IL-1β处理永生化的人类软骨细胞构建了骨关节炎模型。在细胞实验前，通过FTIR、¹H NMR、¹³C NMR、RP-HPLC-ELSD和UPLC-MS确认了β-谷甾醇的身份和纯度。通过qPCR和CCK8检测确定了用于处理细胞的IL-1β和β-谷甾醇的最佳浓度。将细胞分为三组：对照组、模型组和模型+β-谷甾醇组。通过CCK8检测细胞活力。通过qPCR检测IL-18、IL-1β和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的mRNA表达。通过免疫荧光检测II型胶原α1链（COL2A1）和基质金属蛋白酶13（MMP13）的表达。通过流式细胞术检测活性氧（ROS）和线粒体膜电位。通过ELISA和生化测试检测丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）和Fe²⁺。通过透射电子显微镜观察线粒体结构，并通过Western blot检测与铁死亡相关的蛋白质表达。

结果

用IL-1β诱导软骨细胞后，细胞活力下降，炎症细胞因子的基因表达增加，ROS含量和线粒体膜电位降低的细胞比例增加，MDA和Fe²⁺含量增加，GSH含量下降。线粒体结构出现类似铁死亡的变化。COL2A1、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、溶质载体家族7成员11（SLC7A11）、总核因子红细胞2相关因子2（NRF2）和核NRF2的表达下降。MMP13、ANO6和p-p38/p38的水平增加。用β-谷甾醇处理软骨细胞可以逆转IL-1β引起的这些变化。

结论

光谱学证实，高纯度的β-谷甾醇通过抑制炎症激活、细胞外基质降解、线粒体功能障碍和与铁死亡相关的氧化损伤来缓解IL-1β诱导的软骨细胞损伤，表明其作为骨关节炎干预候选化合物的潜力。

引言

骨关节炎（OA）是一种由关节磨损、炎症等因素引起的退行性关节疾病。OA的特点是关节软骨硬化和持续的炎症反应[1]。它是老年人残疾的主要原因[2]，严重影响生活质量。全球OA患者已超过3亿，且发病率逐年增加[3]。OA已成为威胁人类健康的主要疾病。OA的发病机制复杂。以前认为OA是由关节受到过度机械压力导致关节磨损引起的。然而，最近的研究表明，OA受炎症、代谢和多种途径的调控[4]、[5]。在这些致病因素中，导致软骨组织丧失的炎症是OA发生和发展的关键[6]。关节软骨退化是OA的重要病理特征。软骨细胞是软骨组织中唯一通过调节细胞外基质（ECM）的合成和降解来维持其完整性的细胞。软骨细胞的功能障碍与OA密切相关[7]，大规模的软骨细胞死亡会促进OA的发展。研究表明，软骨细胞对自噬、凋亡和坏死的抵抗力较低，容易发生大规模细胞死亡[8]。目前，OA的主要治疗方法是使用药物和激素来缓解疼痛，但这些方法无法修复受损的软骨组织或阻止OA的进展[9]、[10]。需要进一步深入研究以开发OA的治疗方法。

铁死亡是一种不同于凋亡、自噬和坏死的新型细胞死亡方式[11]，它由活性氧（ROS）的积累激活。在铁死亡过程中，会发生脂质过氧化，尤其是在含有多不饱和脂肪酸链的磷脂中[12]。ROS的过量产生会导致细胞膜上的脂质过氧化，从而损害膜完整性和导致细胞死亡[13]。铁死亡的另一个特征是铁稳态失衡。在铁死亡过程中，细胞内的铁代谢失衡，导致铁离子含量增加和Fe³⁺还原为Fe²⁺，产生大量氧化物，造成细胞损伤[14]。铁死亡与多种退行性疾病有关，如脑损伤、阿尔茨海默病、中风和癌症[15]、[16]。铁诱导的细胞死亡与OA的发展密切相关。研究表明，OA中的软骨细胞表现出铁死亡的各种病理特征，如Fe²⁺升高、脂质过氧化和线粒体功能障碍[17]、[18]、[19]。其他研究表明，铁死亡可以促进OA的发展，抑制铁死亡可以保护软骨细胞免受损伤。使用铁死亡抑制剂（铁蛋白-1）可以抑制软骨细胞中的铁死亡，从而延缓小鼠的OA发展[20]。因此，寻找抑制软骨细胞中铁死亡的药物对于开发新的OA治疗方法具有重要意义。

植物甾醇是植物中产生的类固醇，其结构与胆固醇相似，因此它们可以表现出多种药理活性而不会产生明显的生物毒性[21]。作为植物甾醇的主要成分，β-谷甾醇广泛存在于各种植物成分和中药中。研究表明，β-谷甾醇具有抗炎、镇痛、退热、降糖和抗癌作用[22]、[23]、[24]，因此被用于治疗各种疾病。通过网络药理学研究，发现β-谷甾醇对OA具有治疗潜力。关于小活络丸和Smilax glabra Roxb.治疗OA的研究表明，β-谷甾醇是其中的主要活性物质，预计它是治疗OA的潜在活性物质[25]、[26]。此外，预测β-谷甾醇可以减少铁死亡。在关于大戟属植物Euphorbia humifusa治疗肝损伤的内部机制的研究中，网络药理学结果显示，Euphorbia humifusa中的生物活性成分主要是槲皮素和β-谷甾醇，治疗肝损伤的靶点可能与铁死亡有关。通过分子对接发现，β-谷甾醇与这些与铁死亡相关的靶点有很强的亲和力[27]。由于β-谷甾醇对OA的影响尚不清楚，以及β-谷甾醇与铁死亡之间的关系不明确，我们进行了这项研究，以探讨β-谷甾醇是否通过调节铁死亡来影响OA的进展。

章节片段

材料

永生化的人类软骨细胞（IMMOCELL IM-H488，厦门Immocell生物技术有限公司）；永生化的人类软骨细胞专用培养基（IMMOCELL IM-H488-1，厦门Immocell生物技术有限公司）；胰蛋白酶-EDTA消化液（T1300，Solarbio）；1xPBS（0.01M，pH7.4）（KGB5001，KeyGen生物技术有限公司）；β-谷甾醇（HY-N0171A，MCE）；白细胞介素（IL）-1β蛋白（HY-P7028，MCE）；CCK-8细胞增殖检测试剂盒（KGA317，KeyGen生物技术有限公司）；活性氧检测试剂盒

探索IL-1β和β-谷甾醇的处理浓度及其对细胞活力的影响

用不同浓度的IL-1β处理细胞，并通过qPCR检测细胞中IL-1β基因的表达。如图1（A）所示，与0组相比，用5、10、20、30和40 ng/mL IL-1β处理的细胞中IL-1β基因显著增加，其中40 ng/mL处理组的增加最为显著。因此，选择40 ng/mL IL-1β来处理细胞以构建模型。使用不同浓度的β-谷甾醇处理对照组和

讨论

OA是一种以软骨组织退化为特征的退行性疾病，在老年人群中较为常见[28]。软骨组织中软骨细胞的异常功能会促进OA的过程。OA中的软骨细胞容易受到自噬、凋亡和坏死的影响。如何保护软骨细胞免受导致细胞死亡的刺激可能是治疗OA的关键。铁死亡是一种不同于自噬、凋亡和坏死的细胞死亡方式

结论

总之，本研究表明β-谷甾醇可以保护人类软骨细胞免受IL-1β引起的损伤。该化合物首先通过FTIR、¹H NMR、¹³C NMR、RP-HPLC-ELSD和UPLC-MS验证了其结构身份和高纯度。从功能上看，β-谷甾醇提高了细胞活力，减少了炎症介质的表达，保持了细胞外基质标记物的完整性，降低了ROS、MDA和Fe²⁺的积累，恢复了GSH水平，并缓解了线粒体结构

作者贡献声明

张雷：撰写 – 审稿与编辑，资金获取。郭红：撰写 – 审稿与编辑，实验研究。郑银峰：撰写 – 审稿与编辑，数据管理。张雷：撰写 – 初稿，实验研究。孔晓川：撰写 – 审稿与编辑，实验研究

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的竞争性财务利益或个人关系。