ROS响应性微针原位编程巨噬细胞CAR增强胞葬作用并促进黏膜再生的研究

《Biomaterials》：In situ macrophage CAR programming via ROS-responsive microneedles enhances efferocytosis and promotes mucosal regeneration

　　

摘要：头颈部肿瘤放疗常诱发严重的辐射性口腔粘膜炎(Radiation-Induced Oral Mucositis, RIOM)，其特征为过量活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)、巨噬细胞胞葬作用(Efferocytosis)缺陷及持续炎症形成自我放大的病理循环，延迟黏膜修复。现有对症疗法无法同时抑制氧化应激与恢复免疫介导的损伤细胞清除功能。本研究开发了一种具ROS响应性针尖的可分离微针贴片(PTC MN)，用于在RIOM病灶内进行原位巨噬细胞编程。PTC MN由PPBA-TA-PVA水凝胶基质制成，兼具固有ROS清除能力与氧化应激触发降解特性，并负载携带编码CAR-ectoCRT-IL-4质粒的工程化杂合纳米囊泡(HLENs-CAR)。该设计实现了基因负载纳米囊泡的局部递送、巨噬细胞靶向遗传编程及治疗载荷在损伤黏膜中的持续滞留。在小鼠RIOM模型中，PTC MN加速黏膜上皮再生，降低氧化应激与炎性浸润，增强修复型巨噬细胞应答，并减轻纤维化相关组织重塑。功能上，该平台增强巨噬细胞胞葬作用，促进IL-4关联的修复型极化，并将病灶微环境向炎症消退和组织再生方向偏移。综上，本研究建立了一种整合ROS响应微针递送与CAR-巨噬细胞(CAR-Macrophage, CAR-M)编程的智能原位免疫调节策略，为难治性黏膜损伤提供了潜在治疗范式。

论文解读：ROS响应性微针原位编程巨噬细胞CAR增强胞葬作用并促进辐射性口腔粘ositis黏膜再生

研究背景与意义

头颈部肿瘤放射治疗常引发严重的辐射性口腔粘膜炎(Radiation-Induced Oral Mucositis, RIOM)。RIOM病灶微环境以持续高水平的活性氧(Reactive Oxygen Species, ROS)和自放大炎症循环为特征，不仅直接损伤上皮组织，还抑制黏膜修复程序启动。其中，巨噬细胞对凋亡细胞的清除过程称为胞葬作用(Efferocytosis)，是维持组织稳态与促进修复的关键环节；但在高度氧化和炎症状态下，炎症相关金属蛋白酶ADAM17介导MerTK(髓样上皮状病毒受体酪氨酸激酶)裂解，削弱巨噬细胞识别凋亡细胞表面"吃我(eat-me)"信号的能力，导致细胞碎片与危险信号持续累积，延迟炎症消退。当前临床治疗以镇痛和抗炎等对症支持为主，无法从根本上重塑RIOM致病微环境。嵌合抗原受体巨噬细胞(Chimeric Antigen Receptor Macrophage, CAR-M)为赋予巨噬细胞工程化识别与吞噬能力提供了新思路，而相比复杂的体外(ex vivo)制备，原位(in situ)重编程更具转化潜力。口腔黏膜湿润且被唾液冲刷，局部用药滞留时间短，传统注射分布不均且滞留有限。微针(Microneedle, MN)系统可微创穿透黏膜屏障实现深层均匀可控递送。基于此，Qian Yuxin、Wang Wentao、Xin Mingzhe、Ding Haonan、Shuai Yi、Hu Zelong、Wang Xuwen、Huang Shijia、Mu Rui、Zhang Ming及Jin Lei（南京医科大学第一附属医院口腔科等）设计并构建了负载杂合纳米囊泡的ROS响应可分离微针贴片(PTC MN)，相关研究发表于《Biomaterials》。

主要关键技术方法

研究人员首先建立小鼠RIOM模型——C57BL/6小鼠经麻醉后，用定制铅屏蔽板仅暴露口腔，舌前背侧接受单剂量15 Gy X射线照射。材料方面：合成苯硼酸功能化聚磷腈(PPBA)-单宁酸(TA)-聚乙烯醇(PVA)ROS响应水凝胶；从人脐带间充质干细胞(hUC-MSC)分离外泌体，与包裹CAR-ectoCRT-IL-4质粒的脂质体通过冻融—挤压融合制备杂合脂质体-外泌体纳米囊泡(HLENs-CAR)；将HLENs-CAR混入PPBA-TA-PVA前驱液，采用PDMS模具浇筑-冷冻干燥法制备三层可分离微针——含药PPBA-TA-PVA水凝胶针尖层、HA-PVA水溶性中间分离层、PVP背衬支撑层。体外实验包括：DCFH/DHE探针检测ROS清除能力、CMTPX标记辐照L929细胞与CD11b⁺RAW264.7巨噬细胞共孵育流式定量胞葬率、划痕实验检测条件培养基促成纤维细胞迁移、Western blot与RT-qPCR检测IL-4/STAT6/Gas6/CD206表达。体内实验包括：微针贴敷照射舌背使针尖留驻黏膜、甲苯胺蓝染色评估溃疡面积、H&E及天狼星红/免疫荧光(CD206/CD86/Ki-67/α-SMA/CRT/IL-6/IL-10)评估组织修复与巨噬细胞表型、活体荧光成像比较微针与局部注射的局部滞留时间、转录组(RNA-seq)分析差异基因与通路富集。

研究结果

3.1. Pathological characterization of RIOM microenvironment and therapeutic target validation

研究人员通过体外10 Gy辐照L929成纤维细胞发现，辐照后钙网蛋白(Calreticulin, CRT)转位至细胞膜(ecto-CRT⁺细胞由6.24%升至29.01%)，且细胞内ROS(DHE⁺细胞由5.02%升至34.43%)显著升高；体内小鼠RIOM模型显示体重下降、舌背严重溃疡、角化层变薄、中性粒细胞浸润增加，黏膜组织CRT与IL-6上调，巨噬细胞向促炎M1型(CD86⁺)极化而修复型M2型(CD206⁺)减少。结论：RIOM病灶具备高ROS及ecto-CRT暴露特征，伴巨噬细胞功能失调，适合作为靶向ecto-CRT的CAR-M原位编程治疗靶点。

3.2. Construction and characterization of CAR-ectoCRT-IL-4 plasmid and HLENs-CAR nanovesicles

研究人员设计单顺反子CAR-ectoCRT-IL-4质粒——以CRT4单体抗体(monobody)为靶向域识别ecto-CRT，串联CD8α铰链-跨膜域及FcRγ胞内信号域促吞噬，经P2A自剪切肽连接分泌型小鼠IL-4编码序列及T2A-EGFP报告基因，全长由CD68启动子驱动确保巨噬细胞特异性表达。将载质粒细胞外泌体与Lip-CAR融合获得HLENs-CAR，DLS显示粒径约108 nm，TEM呈典型囊泡形，DiO/DiD双标共定位融合效率约89.4%。HLENs-CAR可高效转染RAW264.7使EGFP强表达；胞葬实验显示CD11b⁺/CMTPX⁺双阳细胞由对照组28.23%升至90.39%；Western blot与RT-qPCR证实IL-4/STAT6通路激活、Gas6及M2标志CD206上调；条件培养基促进L929划痕闭合。结论：HLENs-CAR兼具高效基因递送与生物活性免疫调节功能，可使巨噬细胞获得ecto-CRT靶向胞葬能力并分泌IL-4驱动修复型极化。

3.3. Preparation and characterization of ROS-responsive antioxidant PPBA–TA–PVA hydrogel

研究人员合成PPBA并与TA通过硼酸酯-邻苯二酚配位交联，加入PVA通过硼酸酯-二醇相互作用及氢键形成自支撑PPBA-TA-PVA水凝胶。FTIR证实配位网络形成，SEM显示多孔微结构，流变学显示G′＞G″具稳定固态性质。H₂O₂中硼酸酯键ROS敏感断裂致加速降解及质粒释放，PBS中稳定。该水凝胶对H₂O₂、·OH、·O₂^?具浓度依赖性清除能力；LPS刺激RAW264.7中预处理水凝胶可将胞内ROS降至近基线。结论：PPBA-TA-PVA水凝胶具ROS响应降解释药与强抗氧化双重功能，适于RIOM病灶微环境。

3.4. Fabrication and in vitro performance of detachable PTC MN

研究人员以含HLENs-CAR的PPBA-TA-PVA为针尖层、HA-PVA为中间水溶性分离层、PVP为背衬层浇铸制备PTC MN，针尖高0.5 mm、底径0.25 mm、阵列36针，单针断裂力约1.19 N可穿透黏膜；浸入H₂O₂介质针尖渐溶，PBS中完整。ROS条件下降解提取物可转染巨噬细胞表达EGFP、提升胞葬率，并降低LPS诱导胞内ROS。结论：PTC MN为高ROS环境触发选择性降解释药的智能递送系统，释放组分保持生物学活性。

3.5. In vivo therapeutic efficacy of PTC MN in RIOM

研究人员将PTC MN贴敷于照射后小鼠舌背，针尖留驻黏膜。活体成像示微针组局部荧光信号较局部注射组滞留延长至72 h。血液学与主要脏器H&E未见异常，证实系统安全性。舌组织免疫荧光见GFP与F4/80⁺巨噬细胞共定位，证实质粒被原位摄取。甲苯胺蓝染色示PTC MN组溃疡面积小于阳性对照及等量PTC局部注射组；H&E示角化层厚度恢复、中性粒细胞浸润减少；DHE染色示病灶ROS降低；CD206⁺/CD86⁺比值升高，IL-6下调、IL-10上调；天狼星红偏振光示胶原由橙红(粗I型/纤维化)转为绿(新生生理性重塑)，α-SMA降低，Ki-67⁺增殖细胞增多。RNA-seq示上调基因为ECM受体互作、Wnt/Hippo等组织重塑相关通路基因，下调基因为TNF/NF-κB/IL-17等炎症通路基因，GSEA证实TNF与NF-κB通路负富集。结论：PTC MN在体内实现原位CAR-M编程，通过清除ROS与增强胞葬作用打断炎症恶性循环，促进RIOM黏膜上皮再生并抑制放射相关纤维化倾向。

讨论与结论翻译

讨论指出PTC MN通过ROS清除与损伤细胞及时清除打断炎症放大环路，加速照射黏膜结构与功能重建，为放射性损伤及其他难治性炎性病变的局部免疫调节与再生修复提供了可控的治疗途径。

结论原文翻译：综上所述，本研究开发了一种具ROS响应降解针尖的可分离微针贴片用于治疗放疗诱导口腔粘膜炎。PPBA–TA–PVA针尖可发生氧化降解并提供抗氧化活性从而降低局部氧化应激。同时微针释放包裹靶向ectoCRT-CAR质粒的工程化纳米囊泡，诱导巨噬细胞原位免疫重编程，使其识别免疫原性损伤细胞、增强胞葬作用，并通过IL-4相关信号促进组织修复。该策略通过及时消除ROS与损伤细胞打断炎症放大环路，有效加速照射黏膜结构与功能的重建，为难治性炎症病变的局部免疫调节与再生修复提供了可控且具潜力的治疗路径。