轨道杂化介导的纳米酶逆转细胞衰老以促进老年骨再生

《Biomaterials》：Orbital hybridization-mediated nanozymes reverse cellular senescence for aged bone regeneration

　　

老年骨组织的再生因微环境恶化而受到严重损害，其特征为活性氧（ROS）过量以及随之发生的内质网应激（ERS）。研究人员报道了一种通过协同p-d轨道杂化与年轻细胞膜伪装构建的仿生纳米酶，用于精准逆转这一退行性级联过程。所设计的Cu-Sn双原子核心表现出卓越的多酶活性，在清除超氧阴离子方面的效率较Cu单原子对照提高2.5倍。机制研究证实，p-d杂化可重分布Sn位点处的电子密度，从而降低ROS吸附与转化的能垒。该催化核心进一步包覆来源于年轻间充质干细胞与内皮细胞的杂合膜，这一包覆既促进其向衰老骨龛位点的靶向递送，也提供内在的促再生信号。该复合纳米酶可有效缓解老年细胞内氧化应激与内质网应激（ERS），恢复其成骨与成血管潜能。在老年小鼠颌骨缺损模型中，单一治疗方案即可显著促进骨再生，使骨体积分数（BV/TV）提高1.7倍，并显著增强新生骨矿化。该研究建立了一种双重设计原则——以轨道杂化实现催化放大、以年轻细胞膜实现靶向年轻化——为治疗一系列与衰老相关的疾病提供了通用平台。

本文发表于《Biomaterials》，围绕老年颌骨再生障碍这一临床与基础研究交叉难题，提出了一种兼具催化抗氧化、靶向递送和微环境年轻化功能的仿生双原子纳米酶体系。研究背景在于，随着全球人口老龄化加剧，老年个体拔牙创及颌骨缺损的愈合能力明显下降，骨再生缓慢，种植修复前无牙期延长。现有引导骨再生技术虽被广泛应用，但依赖异体、人工或异种材料，存在成本高、感染风险增加以及免疫排斥等局限。与此同时，衰老骨组织微环境中的过量活性氧/活性氮（RONS，活性氧/氮簇）积聚，会进一步诱发内质网应激（ERS，endoplasmic reticulum stress）、钙超载和线粒体功能紊乱，最终导致骨髓间充质干细胞（BMSCs，bone marrow mesenchymal stem cells）成骨能力下降、内皮细胞（ECs，endothelial cells）成血管功能减退。这些问题共同构成了老年颌骨重塑受损的关键病理基础，也解释了开展该项研究的必要性。

基于上述认识，研究人员将老年颌骨血管单元（JVU，jaw vascular unit）视为干预核心，尝试通过“催化核心+年轻膜伪装”的双重设计实现衰老微环境重塑。一方面，研究构建了非对称Cu-Sn双原子位点纳米酶（CuSnDASNs），利用p-d轨道杂化增强类超氧化物歧化酶（SOD）、类过氧化氢酶（CAT）和类谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性，从而高效清除RONS；另一方面，将促血管生成药物Dl-3-n-butylphthalide（NBP）负载于纳米酶内，再以来源于年轻BMSCs和ECs的杂合细胞膜进行包覆，形成CuSnDASNs-NBP-M，以增强对老年JVU的同源性靶向、细胞摄取及促修复信号传递。研究最终证实，该体系不仅能够清除氧化应激，还能减轻ERS、抑制钙超载、恢复衰老细胞的成骨与成血管潜能，并在老年小鼠牙槽窝/颌骨缺损模型中显著促进骨修复。其重要意义在于，该研究把轨道工程、双原子纳米酶和年轻细胞膜仿生策略整合起来，为衰老相关骨再生障碍提供了新的材料学与机制学范式。

研究所采用的关键技术方法主要包括以下几类：首先，通过一锅溶剂热法制备CuSn双原子位点纳米酶，并完成NBP负载及年轻BMSCs/ECs杂合膜包覆；其次，采用TEM、HAADF-STEM、XRD、Raman、XPS、XANES与EXAFS等表征材料形貌、电子结构及局域配位环境；再次，以WST-8、溶氧检测、DTNB、ABTS和DPPH等体系评价其类SOD/CAT/GPx活性及自由基清除能力，并结合密度泛函理论（DFT）阐明p-d轨道杂化机制；随后，在来源于6周龄与18月龄小鼠的BMSCs、ECs及巨噬细胞中开展细胞摄取、RONS、ERS、Ca²⁺、衰老、成骨及迁移实验，并对老年ECs进行RNA-seq；最后，结合人年轻/老年颌骨临床样本及18月龄C57小鼠拔牙创模型，通过CBCT、Micro-CT、HE、Masson和免疫荧光进行体内验证。

3.1. Synthesis and characterizations
研究首先完成了CuSnDASNs及其复合体系的结构构建与理化表征。TEM显示CuSASNs与CuSnDASNs均为纳米点形貌，HAADF-STEM直接可视化到Cu-Sn双原子位点，高分辨二维成像进一步显示Cu-Sn原子对平均原子间距约为2.4 ?，且Cu-Sn配对约占总金属对的66.1%。膜包覆后，CuSnDASNs-NBP-M呈现典型膜包裹纳米点结构。XRD、Raman与XPS结果表明材料具有石墨化碳骨架，且Sn引入后Cu峰结合能负移约0.2 eV，提示Sn向Cu供电子。XANES和EXAFS进一步证明Cu与Sn分别处于+1至+2、+2至+4之间的混合价态，并存在Cu-N、Sn-N及Cu-Sn配位而无明显Cu-Cu或Sn-Sn团聚。该部分结果说明，研究人员成功获得了具有明确局域结构和电子耦合特征的Cu-Sn双原子纳米酶平台，并完成了NBP负载与细胞膜仿生化修饰。

3.2. RONS scavenging
在催化功能方面，研究系统评估了材料对RONS的清除能力。WST-8实验表明，CuSnDASNs的类SOD活性显著高于Cu单原子对照及CuFe双原子对照，超氧阴离子清除能力最强。CAT样活性检测显示，CuSnDASNs能随浓度升高快速催化H₂O₂分解并释放O₂，其Vmax和Km均显示出优于对照材料的催化效率与底物亲和力。GPx样活性分析同样证明，CuSnDASNs在GSH氧化反应中的催化效率明显增强。进一步采用ABTS^•+与DPPH^•两种自由基模型，证实其对氮中心自由基及稳定有机自由基也具有更强的浓度依赖性清除能力。该部分结果支持Sn的引入显著强化了纳米酶的多酶模拟抗氧化性能，使其具备广谱RONS清除潜力。

3.3. DFT calculations
为解释催化增强机制，研究人员进一步开展了密度泛函理论（DFT）计算。部分态密度（PDOS）分析显示，Cu的d轨道与Sn的p轨道具有良好能带匹配，可形成显著的p-d轨道杂化。电子局域函数（ELF）结果提示Cu与Sn之间存在强电子相互作用，且电子更趋向于在Cu位点富集。研究据此提出，Sn向Cu的电子转移导致Cu中心电子富集，而Sn位点电子相对亏缺，进而有利于氧中间体通过σ供电子方式吸附于Sn位点，降低关键反应步骤能垒。自由能分析显示，在类SOD反应路径中，CuSnDASNs的限速步骤能垒低于CuSASNs；在类CAT反应过程中，p-d轨道杂化同样优化了H₂O₂相关中间体吸附与后续转化。该部分从理论层面证明，Cu-Sn双原子结构中的p-d轨道杂化是其高效催化活性的根本来源。

3.4. Biocompatibility and proliferation effect
围绕生物学安全性与基础修复效应，研究选择老年BMSCs和ECs作为JVU关键细胞开展评估。Live/Dead染色显示，无论在24 h还是48 h，CuSnDASNs-NBP-M处理后均未见明显PI阳性细胞增加，提示材料具有良好细胞相容性。CCK-8结果进一步显示，与老年组相比，CuSnDASNs、CuSnDASNs-NBP和CuSnDASNs-NBP-M均可不同程度恢复老年BMSCs和ECs增殖能力，其中以膜包覆并载药的CuSnDASNs-NBP-M效果最显著。说明该体系在维持细胞活性和改善衰老细胞生长状态方面具有优势。

3.5. Cell uptake and RONS clearance ability
研究进一步考察了细胞膜仿生策略带来的递送优势。通过CY5标记纳米平台并对BMSCs（CD73⁺）和ECs（CD31⁺）进行共聚焦观察，发现CuSnDASNs-NBP-M在两类老年细胞中的摄取明显优于未包膜的CuSnDASNs-NBP，说明年轻杂合膜提高了同源性识别与内吞效率。随后，利用DAF-FM、DCFH-DA和MitoNeoD分别检测NO、总ROS及线粒体来源ROS，结果显示老年细胞中RONS水平明显升高，而经三种制剂处理后信号逐渐下降，其中CuSnDASNs-NBP-M降幅最大。SOD活性检测也得到一致结论。该部分表明，膜包覆后的复合纳米酶能够更高效进入靶细胞并广谱清除细胞内RONS，从而为后续功能恢复奠定基础。

3.6. Cellular function, ERS, and calcium overload
在细胞功能层面，研究重点验证了该平台对衰老相关成骨障碍、成血管障碍及应激损伤的逆转作用。首先，年轻BMSCs膜和年轻ECs膜中与成骨、干性维持及血管生成相关的膜受体/上游信号分子表达高于老年来源膜，提示其具备“年轻化”生物信号优势。随后，免疫荧光显示，衰老BMSCs和ECs中氧化DNA损伤标志物8-OHdG明显升高，而经处理后逐步下降。成骨方面，ALP和RUNX2表达在老年BMSCs中受抑，处理后逐渐恢复，且CuSnDASNs-NBP-M组最优；成血管方面，划痕与Transwell结果证实老年ECs迁移能力显著受损，而该组恢复最为明显。附加对照实验还表明，单独M组或NBP组在ROS清除、成骨和成血管上的效果均不理想，而具有p-d杂化效应的CuSnDASNs优于CuFeDASNs，进一步突出了轨道工程设计的重要性。免疫调控方面，iNOS⁺ M1型巨噬细胞在老年组升高，ARG-1⁺ M2型巨噬细胞下降，而CuSnDASNs-NBP-M最能逆转这一失衡；同时，p16和SA-β-gal染色也显示该组对细胞衰老表型抑制最明显。

在内质网应激与钙稳态方面，Western blot显示老年BMSCs和ECs中p-PERK、p-eIF2α和CHOP明显上调，提示未折叠蛋白反应（UPR，unfolded protein response）被强烈激活；经CuSnDASNs、CuSnDASNs-NBP及CuSnDASNs-NBP-M处理后，这些指标逐步下降。ER-Tracker染色显示老年细胞内质网空泡化严重、结构紊乱，而处理后逐步改善。进一步利用Fluo-4 AM与Rhod-2 AM分别检测胞质和线粒体Ca²⁺，发现老年组均存在明显钙外流与钙超载，而治疗后显著减轻。说明该纳米酶不仅抑制氧化应激，还能阻断ERS-钙超载这一衰老损伤通路，进而修复老年颌骨微环境。

3.7. Transcriptomic analysis
为从转录组层面揭示治疗机制，研究对老年ECs接受或未接受CuSnDASNs-NBP-M处理后的样本进行了RNA-seq分析。结果显示，处理后共有2427个基因上调、1155个基因下调。与ERS及Ca²⁺稳态密切相关的Atf4、Atf6、Calr、Ddit3、Derl1、Derl3、Ufd1、Eif2a、Camk2d和Wfs1等在治疗组下调，提示ERS状态被抑制。GO、KEGG和GSEA分析进一步显示，老年ECs富集于内质网蛋白加工、ERS应答、内质网钙离子稳态及内质网未折叠蛋白反应等通路，而治疗后这些异常通路受到纠正。转录因子与蛋白互作网络分析则提示Sp7、Irf1和Hey2等因子可能参与炎症、成骨与血管生成相关基因调控。该部分从系统生物学层面强化了前述细胞实验结论，即CuSnDASNs-NBP-M通过缓解ERS及相关分子网络紊乱改善衰老细胞功能。

3.8. Therapeutic effect of CuSnDASNs-NBP-M in vivo
在体内研究中，作者先对人临床样本进行了对比验证。CBCT显示，老年患者拔牙后6个月的牙槽骨再生明显弱于年轻患者。HE和Masson染色提示老年颌骨存在骨小梁紊乱和胶原沉积减少；免疫荧光显示其SOD水平下降、MDA积累升高，提示氧化应激增强；Endomucin⁺/CD31⁺/RUNX2⁺共定位减少，反映血管-成骨耦联受损；同时p-PERK、p-eIF2α和CHOP升高，说明ERS显著激活。由此，人样本结果明确界定了老年颌骨再生不良伴随的氧化应激和ERS病理图谱。

随后，在18月龄C57小鼠拔除上颌第一磨牙构建老年颌骨缺损模型后，研究比较了不同治疗组的修复效果。Micro-CT三维重建显示，老年组牙槽窝骨形成减少，而CuSnDASNs-NBP-M组在7 d和14 d均表现出最突出的新骨生成，BV/TV显著升高；同时，该组黏膜愈合亦优于其他组。HE和Masson结果显示，其骨小梁排列紊乱得到改善，胶原沉积增加。免疫荧光进一步证明，治疗后SOD水平恢复、MDA下降，Endomucin⁺/CD31⁺/RUNX2⁺共定位增强，说明成骨和成血管能力同步恢复；p-PERK、p-eIF2α和CHOP下降，则说明体内ERS也被有效缓解。主要脏器HE染色未见明显形态学异常，提示该体系具有较好的体内安全性。该部分证明，CuSnDASNs-NBP-M能够在真实老年骨缺损环境中同步改善氧化应激、ERS、血管化和骨形成，最终促进颌骨重塑。

综合讨论来看，本文的核心创新在于将非对称Cu-Sn双原子位点的p-d轨道杂化效应，与来源于年轻BMSCs/ECs的杂合细胞膜靶向伪装有机结合，建立了“催化放大+年轻化递送”的双重设计框架。研究结果一贯表明，该体系较未包膜或未载药组具有更优的细胞摄取、更强的RONS清除、更显著的ERS抑制及更全面的成骨-成血管修复能力。其意义不仅体现在老年颌骨修复这一具体场景，也提示通过调控活性位电子结构并结合年轻来源生物膜信号，可为多种衰老相关退行性疾病开发新型仿生纳米治疗平台。

研究结论可译为：总之，本研究通过简便方法构建了一种基于非对称Cu-Sn双原子位点的年轻化JVU仿生纳米酶，用于老年颌骨重塑。得益于非对称Cu-Sn二聚结构之间独特的p-d轨道杂化，所得CuSnDASNs表现出优异的RONS清除效率。理论计算进一步揭示，双金属原子间的p-d轨道杂化效应改善了催化性能，促进ROS在活性Cu-Sn双原子位点上的吸附。年轻BMSCs/ECs膜的组合赋予了材料仿生信号传递和细胞摄取方面的独特优势。该整合的年轻杂合膜可靶向JVU，从而促进老年BMSCs的成骨分化和老年ECs的成血管分化。更关键的是，该纳米酶可缓解老年细胞中的内质网应激并抑制钙超载。结合NBP的促血管生成作用，该体系在老年小鼠下颌骨缺损中将骨再生提高了1.7倍。总体而言，本研究为利用强p-d轨道杂化开发双原子纳米酶以实现老年颌骨重塑开辟了新途径。