两亲性大环磁共振成像造影剂亲水性工程改造以增强肝脏靶向效率

《Biomaterials》：Hydrophilicity Engineering of Amphiphilic Macrocyclic MRI Contrast Agents for Enhanced Hepatic Targeting Efficiency

　　

有效实现肝脏增强及高动力学惰性是开发基于钆（Gd, III)的肝胆磁共振成像（MRI)造影剂（CAs)的关键驱动力。尽管亲脂性修饰在促进肝脏摄取方面占据主导地位，但亲水性的重要作用却被忽视。本研究通过亲水性工程精细调控两亲性大环配合物，探究其构效关系。水溶性配合物Gd-HE(BnOPh)-DO3A表现出卓越的动力学惰性，在pH 1.2条件下解离半衰期为8.3 h，较非羟基化对照物Gd-BnOBn-DO3A的1.7 h延长近5倍。更为重要的是，Gd-HE(BnOPh)-DO3A实现了快速而显著的肝脏增强，注射后仅2 min即观察到信号强度增加3.1倍；而两亲性Gd-BnOBn-DO3A则呈现延迟性肝增强，于30 min达峰。这些显著不同的药代动力学特征可能源于分子组装行为的改变。Gd-HE(BnOPh)-DO3A中羟基的引入打破了两亲性平衡并阻止了纳米颗粒自组装，使其以小分子形式实现快速肝脏增强；相反，Gd-BnOBn-DO3A动态形成水合粒径超过200 nm的纳米颗粒，导致较慢的肝脏摄取。总之，该研究确立了战略性亲水性工程作为一种有效且此前被低估的优化CAs肝脏靶向的方法，为MRI造影剂设计提供了独特见解。

本研究旨在解决肝胆MRI造影剂开发中的核心挑战，即如何在保证高动力学稳定性的同时实现有效的肝脏靶向增强。目前临床应用的线性钆基造影剂如钆塞酸二钠（Gd-EOB-DTPA, 商品名Primovist）和钆贝葡胺（Gd-BOPTA）虽具有肝细胞特异性，但因其线性结构动力学稳定性不足，存在钆离子（Gd³⁺）体内沉积及肾源性系统性纤维化（NSF）风险，欧洲药品管理局（EMA）已暂停多数线性钆基造影剂的上市许可。大环结构虽能提升稳定性，但现有研究多聚焦于亲脂基团引入以促进肝摄取，忽视了亲水性基团对造影剂性能调控的关键作用。为此，研究人员设计并合成了两种结构高度相似但亲水性存在差异的大环钆螯合物——含羟基的八齿配体Gd-HE(BnOPh)-DO3A与不含羟基的七齿配体Gd-BnOBn-DO3A，通过系统对比研究揭示亲水性精细调控对造影剂物理化学性质、动力学惰性及体内肝脏成像效能的影响机制，以期开发可替代Gd-EOB-DTPA的新型安全肝胆造影剂。该研究成果发表于《Biomaterials》。

研究采用的关键技术方法包括：通过高效液相色谱法（HPLC）测定亲脂性参数（log P）；采用芘荧光探针法测定临界聚集浓度（CAC）；利用临床1.5 T MRI仪测定纵向弛豫率（r₁）和横向弛豫率（r₂）；基于铽（Tb, III)配合物⁷F₆→⁵D₄跃迁的荧光寿命测定内层配位水分子数（q值）；采用Arsenazo III显色法及弛豫率法分别在强酸条件（pH 1.2）和过量锌离子（Zn²⁺）干扰下评价动力学惰性；运用AutoDock分子对接模拟分析配合物与OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1及NTCP（钠离子-牛磺胆酸共转运多肽）的亲和作用；使用H22细胞建立原位肝细胞癌（HCC）KM小鼠模型进行在体MRI评估；通过电感耦合等离子体发射光谱法（ICP-OES）和电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）进行生物分布及药代动力学分析。

在分子设计与合成方面，研究人员以1,4,7,10-四氮杂环十二烷（cyclen）为骨架，经Corey-Chaykovsky反应环氧化、侧链接枝及开环反应构建羟基，最终与Gd₂O₃络合得到两种配合物。Gd-HE(BnOPh)-DO3A由于环氧开环步骤产生手性中心，最终为外消旋体。

在亲脂性与自组装行为研究中，两种配合物的估算log P值分别为1.38和1.40，均高于Gd-EOB-DTPA（0.74），表明其具有更强的亲脂性。然而关键差异在于：Gd-BnOBn-DO3A的CAC值低至224.6 mg/L，浓度超过CAC时可形成水合粒径约281.6 nm的纳米颗粒；而Gd-HE(BnOPh)-DO3A因羟基存在几乎不显示浓度依赖性聚集。这表明微小结构差异导致Fm导致截然不同的分子组装行为。

在弛豫性能评价中，两种配合物在pH 7.4的Tris缓冲液中r₁值分别为4.9和5.0 Gd mM^-1s^-1-1s<sup>-11值增至8.6 Gd mM-1s-1
在水合状态测定中，通过Tb(III)类似物荧光寿命测定得出Tb-BnOBn-DO3A和Tb-HE(BnOPh)-DO3A的q值分别为1.83和1.14，与理论值一致。

在动力学惰性评价中，pH 1.2条件下Gd-HE(BnOPh)-DO3A的解离半衰期（t_1/2）达8.3 h，分别是Gd-BnOBn-DO3A（1.7 h）、Gd-HP-DO3A（2.4 h）的约5倍和3.5倍，而Gd-EOB-DTPA在5 min内完全解离。Zn2+竞争置换实验及pH 4-7.4稳定性测试进一步证实Gd-HE(BnOPh)-DO3A具有最优的抗干扰能力，其优异稳定性归因于BnOBn基团增强的环骨架刚性及羟基结构的协同稳定效应。

在分子对接研究中，两种配合物与OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1及NTCP均显示结合亲和力，其中Gd-BnOBn-DO3A对OATP1B1和OATP1B3亲和力更高，而Gd-HE(BnOPh)-DO3A对OATP2B1亲和力更优；两者对OATPs和NTCP的亲和力均显著优于Gd-EOB-DTPA。与人血清白蛋白（HSA）的对接分数分别为-9.10和-9.90 kcal/mol，结合能力相近。

在生物安全性评价中，两种配合物在HEK-293和Raw264.7细胞中于500 μM浓度下细胞存活率仍超90%；溶血率均低于ASTM标准的5%；Gd-HE(BnOPh)-DO3A在KM小鼠中的急性毒性实验显示主要器官H&E染色无病理改变，肝肾功能生化指标正常。

在正常小鼠肝脏MRI中，Gd-HE(BnOPh)-DO3A注射后2 min即实现肝实质信号强度增加3.1倍，与Gd-EOB-DTPA相当，且维持稳定至30 min；同时显示快速双相排泄特征——肾盂和膀胱信号迅速增强。相反，Gd-BnOBn-DO3A呈延迟增强模式，2 min时肝信号仅增加1.7倍，30 min方达峰值3.1倍，且肾脏排泄延迟。溴磺酞（BSP）竞争性抑制实验证实，Gd-HE(BnOPh)-1?3A<的肝脏摄取可被OATP抑制剂BSP显著阻断，表明其经OATP介导的肝细胞摄取机制与Gd-EOB-DTPA类似。

在HCC小鼠诊断应用中，Gd-HE(BnOPh)-DO3A与Gd-EOB-DTPA均能快速实现肿瘤-肝实质对比，注射后2 min时对比度噪声比（CNR）值显著优于Gd-EOB-DTPA（p < 0.05），展现更优的早期诊断性能；而Gd-BnOBn-DO3A因延迟增强特性在短时期内成像效果较差。

在生物分布与药代动力学研究中，Gd-HE(BnOPh)-DO3A注射后5 min肝蓄积达给药剂量的40%，20 min降至20.7%，120 min仅余3.1%；血浆清除呈双相指数衰减，分布半衰期（t_1/2α）0.64 min，消除半衰期（t_1/2β）12.98 min。48 h内粪便和尿液累积排泄率分别为74.3%和20.4%，总清除率达94.7%。Gd-BnOBn-DO3A则显示缓慢肝摄取（5 min仅4.6%）和长循环特征（t_1/2β 37.88 min），30 min方达峰值蓄积48%。

在讨论与结论部分，研究人员指出两配合物结构微小差异（羟基有无）导致物理化学性质、自组装行为及体内命运的显著分化。Gd-BnOBn-DO3A因低CAC值易自组装为纳米颗粒，表现出纳米造影剂的延迟肝摄取和缓慢代谢特征；而Gd-HE(BnOPh)-DO3A通过羟基引入打破两亲性平衡、抑制纳米颗粒形成，维持小分子快速扩散和OATP介导的高效肝细胞摄取。该研究正式结论为：本研究在两种新型大环钆螯合物Gd-BnOBn-DO3A和Gd-HE(BnOPh)-DO3A中探究了亲水性修饰对肝细胞特异性成像潜力的影响。尽管羟基存在与否仅造成微小结构差异，但两者在亲水性、动力学惰性、肝脏成像特征及体内分布方面呈现显著差异。首先，八齿螯合物Gd-HE(BnOPh)-DO3A因羟基存在而表现出优于七齿螯合物Gd-BnOBn-DO3A的动力学惰性。尽管弛豫率、亲脂性及OATP亲和力相似，两种造影剂在肝脏MRI中表现迥异：Gd-HE(BnOPh)-DO3A显示出与Gd-EOB-DTPA相当的肝细胞靶向能力，实现快速而显著的肝脏对比增强；相反，Gd-BnOBn-DO3A呈现延迟增强和较差的短期肝脏成像，可能归因于无羟基导致的低CAC值促进纳米颗粒形成，从而表现出类纳米造影剂特征。体内生物分布研究进一步验证了两者的差异化肝脏蓄积模式，Gd-HE(BnOPh)-DO3A通过双通道（肝胆和肾）快速清除。BSP抑制成像表明Gd-HE(BnOPh)-DO3A的肝脏靶向机制可能经OATP介导实现。总之，本研究提出的羟基精细调控亲水性工程策略有效抑制了过度亲脂修饰导致的分子间聚集，从而确保快速而显著的肝脏摄取，有望作为一种优化体内药物分布和递送的有效方法。</sup>