一种新型基于二茂铁的安培法生物传感器用于测定食品样品中有毒酪胺

《Food Analytical Methods》：A New Ferrocene-Based Amperometric Biosensor to Determine Toxic Tyramine in Food Samples

　　

酪胺作为一种生物胺，摄入高含量后可引发头痛、心悸及高血压危象等严重健康问题。因此，开发一种简便、快速且准确的食品样品中酪胺含量测定方法至关重要。本研究基于此目的，开发了一种新型基于单胺氧化酶（monoamine oxidase, MAO）的安培法生物传感器。研究人员将酶固定于经席夫碱1-氯-2-甲酰基乙烯基二茂铁-3-氨基-2-萘酚（1-chloro-2-formyl vinyl ferrocene-3-amino-2-naphthol, vFc3A2N）修饰的碳糊电极（carbon paste electrode, CPE）表面。通过在该修饰电极上氧化酶促反应产生的H₂O₂，于+0.5 V（vs. Ag/AgCl）电位下实现酪胺的测定，且固定化后酶活性未出现损失。研究人员系统考察了所制备生物传感器的最优操作条件及其性能影响因素，包括vFc3A2N用量、重现性、保质期及干扰效应等。结果表明，该酪胺生物传感器在30天后仍保留其初始安培响应的44.7%。最终，研究人员利用所设计的生物传感器对奶酪样品中的酪胺进行了测定，结果显示该传感器具有较高的灵敏度与选择性。

酪胺（tyramine）属于芳香族生物胺，由酪氨酸和苯丙氨酸经脱羧反应生成，广泛存在于大豆制品、各类奶酪、酒精饮料及巧克力等食品中。过量摄入酪胺可导致头痛、心悸、恶心、呕吐及高血压危症等健康损害，其中"奶酪反应"（cheese reaction）更是可能引发严重偏头痛乃至脑出血。鉴于酪胺在发酵乳制品中的积累特性及其毒性阈值（100–400 mg/kg），建立高效、灵敏的检测方法对保障食品安全具有重要意义。

传统检测技术如薄层色谱（thin-layer chromatography, TLC）、气相色谱（gas–liquid chromatography, GLC）及高效液相色谱（high-performance liquid chromatography, HPLC）虽应用广泛，但存在设备昂贵、操作繁杂、需专业培训人员等固有缺陷。相较而言，电化学生物传感器凭借高灵敏度、操作简便、响应快速、选择性好及可微型化等优势，为酪胺检测提供了替代方案。其中，二茂铁基席夫碱（ferrocene-based Schiff bases）因其低成本、易合成、可修饰性强，且在氧化还原反应中具有高稳定性，成为提升工作电极性能的理想修饰材料。其快速电子转移能力、电化学稳定性及高导电性使其可作为氧化还原介体（redox mediator），并通过弱相互作用实现酶在电极表面的稳定固定。本研究所采用的新型vFc3A2N席夫碱区别于常见二茂铁衍生物，其萘酚（naphthol）官能团可拓展π-π相互作用范围，增强氧化还原信号。

研究人员采用CHI 1230-A电化学分析仪，配合铂辅助电极、Ag/AgCl（3 M KCl）参比电极及碳糊工作电极（表面积0.30 cm²）构成三电极体系。碳糊电极由石墨粉与液体石蜡（Nujol）混合填充于聚四氟乙烯管中制备；修饰碳糊电极（modified carbon paste electrode, MCP）则在碳糊基质中加入2.5 mg vFc3A2N席夫碱制得。酶电极（modified carbon paste enzyme electrode, MCPE）的制备采用交联法（cross-linking method）：将牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）、pH 10.0甘氨酸缓冲液、戊二醛（glutaraldehyde, GA）及单胺氧化酶（来源于黑曲霉Aspergillus niger）混合液滴加于MCP表面，室温干燥后蒸馏水清洗，于4 °C缓冲液中保存备用。

测定原理基于单胺氧化酶催化酪胺氧化生成对羟基苯乙醛、氨及H₂O₂的反应，通过检测H₂O₂在+0.5 V处的阳极氧化电流实现定量。具体操作为：将MCPE置于含1 M NaCl支持电解质与pH 10.0甘氨酸缓冲液的电解池中，+0.5 V下平衡至稳定电流（i_b），加入酪胺溶液搅拌200 s后记录电流（i_a），以Δi = i_a ? i_b作为定量依据。

**碳糊电极与修饰碳糊电极对H₂O₂的灵敏度比较**

研究人员首先比较了CP与MCP对H₂O₂的响应差异。在+0.7 V工作电位、0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.0）条件下，MCP对H₂O₂的阳极响应电流约为CP的10倍。这一增强效应归因于二茂铁及二茂铁基化合物加速了酶与底物间的电子传递，证实vFc3A2N修饰显著提升了电极灵敏度。

**电化学表征及最优工作电位与vFc3A2N用量的确定**

采用5 mM K₃Fe(CN)₆/0.10 M H₂SO₄体系进行循环伏安法（cyclic voltammetry, CV）表征。结果显示CP与MCP均呈现清晰的氧化还原峰，峰电位差（ΔE_p）约80 mV（扫速100 mV s^?1），表明为准可逆电子转移过程；电子转移系数（α）约0.60，异相电子转移速率常数（k⁰）为3 × 10^?3 cm s^?1。

工作电位优化实验在0.3–0.6 V范围内考察H₂O₂响应。虽高电位对应更高响应电流，但考虑到实际样品中其他物质的干扰风险，最终选定+0.5 V作为平衡高响应、低干扰、良好线性及高R²值的最优工作电位。

vFc3A2N用量优化实验中，比较了含1.5 mg、2.5 mg和3.5 mg vFc3A2N的三种MCP。结果表明含2.5 mg vFc3A2N的电极兼具最佳线性与最高响应电流，而3.5 mg用量因机械稳定性下降被排除。

**戊二醛用量、pH及温度的确定**

交联剂戊二醛用量优化显示，20–30 μL（2.5%）范围内电流随用量增加而升高，40 μL时则因过度交联导致酶活性位点被占据而下降。后续研究采用30 μL戊二醛进行酶固定化。

通过Michaelis–Menten作图法确定最优pH为10.0。vFc3A2N可通过稳定酶基团的离子化状态并改善酶-修饰剂间相互作用，提升酶在高pH条件下的稳定性。温度优化实验（20–90 °C）显示，电流随温度升高至80 °C达最大值，90 °C时酶完全变性失活。尽管该温度对酶而言偏高，但vFc3A2N赋予单胺氧化酶特殊的热稳定性，这一特性在文献报道的酪胺生物传感器中较为罕见。出于实用性考虑，实际分析于室温下进行。

**底物浓度对酪胺生物传感器响应的影响**

在+0.5 V、pH 10.0条件下，考察1.0 × 10^?10至2.0 × 10^?6 M酪胺浓度的响应特性。获得线性范围1.0 × 10^?8至1.0 × 10^?7 M（R² = 0.9942），响应时间200 s，检出限（limit of detection, LOD）6.10 × 10^?9 M，定量限（limit of quantification, LOQ）2.03 × 10^?8 M。值得注意的突出发现是，固定化后酶活性几乎无变化，这与交联法通常导致酶活性下降的预期相悖。研究人员认为vFc3A2N作为氧化还原介体加速了电子转移，其石墨表面π-π相互作用及石蜡中的疏水作用共同促成了这一罕见优势。

通过Lineweaver–Burk双倒数作图求得表观米氏常数K_m^(eye) = 1.72 × 10^?4 μM，最大响应电流I_max^(eye) = 0.1724 μA。极低的K_m值表明酶对底物具有极高亲和力，vFc3A2N修饰显著增强了单胺氧化酶对酪胺的催化活性。

**生物传感器重现性与保质期的确定**

重现性考察显示，13次连续测定后性能下降5.5%，相对标准偏差（relative standard deviation, RSD）为7.5%。储存稳定性方面，30天后生物传感器保留初始安培响应的44.7%，优于文献报道的同类酪胺生物传感器。

**干扰物质影响考察及奶酪样品中酪胺的测定**

干扰实验考察了酪氨酸、色氨酸、组氨酸及赖氨酸的影响，干扰率分别为1.7%、6.4%、7.7%及5.5%，表明传感器具有良好的选择性。应用于Parmesan奶酪样品分析时，酪胺含量测定值为117.40 ± 11.41 mg/kg，与文献报道的103 mg/kg相符。

研究结论部分明确指出：本研究制备了基于单胺氧化酶的安培法生物传感器，首次将vFc3A2N席夫碱作为修饰材料用于酪胺检测，有效提升了生物传感器灵敏度。+0.5 V工作电位、pH 10.0、80 °C最优温度及200 s响应时间等参数得以确立。线性范围1.0 × 10^?8至1.0 × 10^?7 M（R² = 0.9942）及6.10 × 10^?9 M的检出限表明该生物传感器可在极低浓度下实现酪胺测定。综上，该生物传感器具有响应时间快、线性范围宽、检出限低、重现性好、保质期可接受等优势，且制备简便、成本低廉，为食品样品中酪胺的高灵敏、高选择性检测提供了有效工具。该论文发表于《Food Analytical Methods》。