N-羟基异胞苷：一种直接作用的广谱抗呼吸道病毒药物，对MERS-CoV具有强效活性

《Bioorganic Chemistry》：N-hydroxy-isocytidine: A direct-acting broad-Spectrum antiviral agent against respiratory viruses with potent activity against MERS-CoV

　　

研究人员设计、合成并评估了一系列C2修饰的嘧啶核苷及氨基磷酸酯衍生物，针对一组呼吸道病毒进行筛选。其中，N-羟基异胞苷（化合物5）对SARS-CoV、SARS-CoV-2、人冠状病毒（HCoV）、呼吸道合胞病毒（RSV）及流感病毒展现出广谱抗病毒活性，并对中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）具有强效活性（半数有效浓度EC₅₀?=?1.27?μM，选择指数SI₅₀?>?300）。在相同条件下，核苷化合物5的选择性指数比瑞德西韦（remdesivir）高出约十倍。氨基磷酸酯衍生物化合物6对甲型流感病毒H1N1（A/California/07/2009）的效力增强，EC₅₀为0.49?μM，SI₅₀?>?380。构效关系研究显示，抗病毒活性对核碱基和糖基的修饰高度敏感，C2-肟取代、4-氧代修饰、2′-C-甲基化或2′-立体化学反转等改变均会降低或消除活性。密度泛函理论分析表明，C2-肟的形成稳定了一种类似嘌呤的互变异构体，为活性提供了结构基础。化合物6增强的活性支持了化合物5在细胞内高效转化为其活性三磷酸形式，该形式通过掺入后抑制病毒RNA延伸。这些发现将N-羟基异胞苷鉴定为一种有前景的直接作用抗病毒药物，并凸显了核碱基与糖基修饰在调节抗病毒活性中的重要性。

**论文解读：N-羟基异胞苷——一种靶向呼吸道病毒的广谱直接作用抗病毒药物**

**研究背景、现存问题与研究意义**

在过去二十年中，由严重冠状病毒引发的呼吸道疾病疫情持续暴发，对全球公共卫生构成重大威胁。中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）自2012年在沙特阿拉伯和约旦首次被发现以来，在人类中引起严重的下呼吸道疾病，确诊病例的病死率高达约35-37%。尽管实施了监测和感染控制措施，但零星的人畜共患传播和院内暴发仍时有发生，目前尚无针对MERS-CoV感染的特异性抗病毒疗法或获批疫苗。核糖核苷及核苷酸类似物是抗病毒药物的重要类别，其作用机制通常是通过抑制病毒依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）。虽然瑞德西韦（remdesivir）和N-羟基胞苷（N-hydroxycytidine）等药物已展现出抗冠状病毒活性，但临床上仍亟需开发具有更高疗效和选择性的新型抗MERS-CoV药物。对嘧啶核苷的C2位点进行修饰，能够改变碱基几何结构、电子分布和互变异构平衡，从而影响碱基识别、碱基配对和突变率，是一种有效的药物设计策略。基于此，研究人员旨在设计并合成一系列C2修饰的嘧啶核苷类似物，探索其对包括MERS-CoV在内的呼吸道病毒的抗病毒活性，并阐明其构效关系（Structure–Activity Relationship, SAR）和作用机制。该论文发表在《Bioorganic Chemistry》。

**主要技术方法概况**

本研究主要采用了以下关键技术方法：1）**有机合成化学**：通过Vorbrüggen糖基化反应、亲核取代反应、肟化反应、硫代反应、去保护反应以及氨基磷酸酯前药（phosphoramidate prodrug）合成等步骤，设计并合成了一系列C2修饰的嘧啶核苷及氨基磷酸酯衍生物。2）**密度泛函理论（Density Functional Theory, DFT）计算**：使用ωB97X-D泛函和6–311+G*基组，在Spartan 24软件中对关键化合物进行几何优化，分析其优势互变异构体及其构象。3）**体外抗病毒活性评估**：在美国国立变态反应与传染病研究所（NIAID）资助下，分别于犹他州立大学抗病毒研究所和阿拉巴马大学伯明翰分校，针对多种病毒进行细胞水平的抗病毒活性测试，包括MERS-CoV（EMC株，Vero 76细胞）、SARS-CoV（Urbani株，Vero 76细胞）、SARS-CoV-2（USA_WA1/2020株，Vero E6细胞）、人冠状病毒α（229E株，HEL 299细胞）、甲型流感病毒（IAV）H1N1等不同亚型（MDCK细胞）、乙型流感病毒（IBV，MDCK细胞）、呼吸道合胞病毒（RSV，A2株，MA-104细胞）。此外，还评价了化合物对其他RNA病毒（如HCV、YFV、DENV-2、WNV等）和DNA病毒（如HSV-1、ADV、HBV等）的活性。通过细胞病变效应（CPE）抑制观察和中性红（Neutral Red）染色法测定半数有效浓度（EC₅₀）和半数细胞毒性浓度（CC₅₀），并计算选择指数（Selectivity Index, SI）。

**研究结果**

**2.1. 化学合成 (Chemistry)**
研究人员成功合成了一系列目标化合物。其中，关键中间体2-甲基硫尿嘧啶核苷类似物15是通过对2-甲基硫尿嘧啶进行Vorbrüggen糖基化反应高效制得。进而通过肟化反应得到关键中间体16，脱保护后获得目标化合物N-羟基异胞苷（5）。通过将化合物5与氨基磷酸酯试剂18反应，得到其单磷酸前药化合物6。此外，研究人员还合成了C4-硫代类似物（8）、C2-氰基亚胺类似物（7, 19）、2'-C-甲基取代类似物（9, 10）以及阿拉伯糖构型类似物（11-13），用于进行系统的构效关系研究。

**2.2. 几何优化 (Geometrical Optimizations)**
通过DFT计算研究发现，化合物5、8、9和11在水溶液中的优势互变异构体均为E构型的C2=N-OH（互变异构体I），其波尔兹曼分布为1。在化合物5中，2'-OH基团与E-C2=N-OH部分之间形成的分子内氢键，以及N3H与肟氧之间的氢键，有助于稳定这种优势构象。这种“锯齿形”构象使得嘧啶核苷呈现出类嘌呤（purine-like）的结构特征。计算结果表明，将C2羰基转化为肟基（oxime）会优先促进嘧啶核苷形成类嘌呤构象，这为改变碱基识别和后续生物活性提供了结构基础。

**2.3. 抗病毒活性评估 (Antiviral evaluations)**
* **N-羟基异胞苷（5）的广谱抗病毒活性**：化合物5展现出广谱抗呼吸道病毒活性。其对MERS-CoV表现出极强的抑制活性（EC₅₀ = 1.2 μM, EC₉₀ = 2.97 μM, CC₅₀ > 385 μM, SI₅₀ > 300），其活性比对照药物瑞德西韦（EC₅₀ = 5.6 μM, CC₅₀ > 108 μM, SI₅₀ > 19）高出超过15倍。化合物5对SARS-CoV、SARS-CoV-2、人冠状病毒（HCoV）、RSV以及甲型（IAV-H1N1等）和乙型流感病毒也表现出抑制活性。
* **氨基磷酸酯前药（6）的活性**：化合物6作为化合物5的单磷酸前药，旨在绕过限速的初始磷酸化步骤。其对甲型流感病毒H1N1（A/California/07/2009）的活性较母体核苷5增强了约3倍（EC₅₀ = 0.49 μM, SI₅₀ > 380）。然而，其对MERS-CoV的活性相比母体核苷5有所降低，这可能与细胞系差异及前药活化效率的细胞依赖性有关。
* **构效关系分析**：系统修饰研究表明，抗病毒活性对结构变化高度敏感。将化合物5中的4-氧代（C4=O）替换为4-硫代（C4=S）得到化合物8，导致对所有测试病毒的活性完全丧失。在C2位引入氰基亚胺基（C2=N-CN）得到化合物7和19，同样消除了抗病毒活性。对糖基进行修饰也具有破坏性影响：在核糖2′-位引入β-甲基（化合物9）或反转2′-立体构型得到阿拉伯糖类似物（化合物11），均导致活性完全丧失。综上所述，C2肟修饰是保持抗病毒效力的关键，而化合物5具有最优的活性谱。

**总结讨论与结论**

本研究通过系统的构效关系分析，揭示了N-羟基异胞苷（5）的抗病毒活性决定因素。研究表明，保持C2的肟基（oxime）官能团和天然的核糖呋喃糖构型（ribo configuration）对于抗病毒活性至关重要，而核碱基的修饰（如C4-硫代、C2-氰基亚胺取代）、糖基2′-C-甲基化或2′-立体构型的反转均会导致效力降低或丧失。基于化合物6活性增强的结果，支持化合物5通过在细胞内高效转化为活性三磷酸形式，进而在掺入后抑制病毒RNA延伸的作用机制。DFT计算进一步表明，肟的形成稳定了一种类嘌呤的核碱基构象，这可能增强了聚合酶对其的识别。综合以上结果，本研究确定了N-羟基异胞苷作为一种有前景的直接作用抗病毒药物（Direct-Acting Antiviral, DAA）先导化合物，并为针对新兴冠状病毒进行进一步优化提供了清晰的结构框架。

研究结论部分翻译如下：
总之，本研究将N-羟基异胞苷（5）确定为一种具有广谱抗呼吸道病毒活性且对MERS-CoV具有显著疗效的直接作用抗病毒核苷。化合物6对甲型流感病毒增强的活性支持了化合物5在细胞内高效转化为其活性三磷酸形式，该形式通过掺入后抑制病毒RNA的延伸。系统的构效关系分析表明，保持C2肟官能团和天然的呋喃核糖构型对于抗病毒活性至关重要，而核碱基修饰、糖基取代或C-2′位立体化学反转均会导致效力降低。计算研究进一步表明，肟的形成强制形成一种类嘌呤核碱基构象，这可能增强了聚合酶的识别。总之，这些结果为抗病毒活性建立了一个清晰的结构框架，并将N-羟基异胞苷定位为一种值得针对新兴冠状病毒进行进一步优化的先导化合物。