从红球菌属(Rhodococcus)基因组数据库中鉴定出具有破坏表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)细胞膜能力的非核糖体肽(NRP)

《Bioorganic Chemistry》：Identification of a NRP with the ability to destroy cell membrane of Staphylococcus epidermidis from Rhodococcus genomes database

　　

随着临床上由表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)引起的感染不断上升以及现有抗生素耐药威胁加剧，迫切需要鉴定针对表皮葡萄球菌的新型抗菌肽(AMP)。然而大多数微生物难以培养，通过常规生物测定引导分馏发现新型抗菌肽较为困难。本研究从公共数据库中的数百个红球菌属(Rhodococcus)基因组中挖掘了数千个非核糖体肽合成酶(NRPS)生物合成基因簇(BGC)，并利用生物信息学工具预测所选NRPS合成的非核糖体肽(NRP)核心分子骨架。研究人员通过化学合成获得一个NRP类似物A8–5-line，其对表皮葡萄球菌表现出较强活性。基于构效关系(SAR)研究，将C端亲水性谷氨酰胺残基替换为疏水性丙氨酸残基得到衍生物A8NO5，其抗菌活性显著增强。机制研究表明A8NO5能有效破坏细菌细胞膜完整性。代谢组学分析显示A8NO5处理后会扰乱核苷酸代谢通路，改变的核苷酸相关代谢物很可能是膜损伤及伴随代谢崩溃的下游效应。此外，A8NO5在体外表现出可忽略的细胞毒性和溶血活性，表明其具有良好生物安全性。综上，这些发现使A8NO5成为开发新型杀菌剂的潜在先导化合物。

研究背景方面，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)是人体皮肤与黏膜的正常共生菌，当突破皮肤屏障进入血流时可作为条件致病菌引起院内感染，尤其是器械相关感染（如人工关节、心脏起搏器、中心静脉导管等）。其致病性主要归因于在生物材料表面形成生物膜，增强附着并保护细菌抵御宿主免疫防御。现有抗生素面临耐药性危机，而抗菌肽(AMP)因广谱活性、独特作用模式（如膜破坏）和低耐药倾向成为传统抗生素的有前景替代物。在非核糖体肽(NRP)中，由非核糖体肽合成酶(NRPS)合成的一类NRP因可引入非蛋白氨基酸、形成线性、环状或高度分支等结构多样性及多样作用机制受到关注，例如达托霉素(daptomycin)通过靶向破坏细胞膜快速杀菌。红球菌属(Rhodococcus)属于放线菌门(Actinomycetota)，富含NRPS生物合成基因簇(BGC)，是发现新型具抗菌特性NRP的潜在储库。传统微生物培养依赖性强，大多数微生物难在人工条件下培养，限制了新AMP发现效率。基于生物信息学工具从大规模基因组数据集中筛选BGC、预测结构并由化学合成直接制备天然产物类似物即合成生物信息天然产物(syn-BNP)的策略克服了培养限制，节省时间与经济成本。本研究采用syn-BNP策略，分析数据库中红球菌属基因组丰富的NRPS BGC，成功鉴定出抗表皮葡萄球菌的抗菌肽，通过构效关系(SAR)优化活性并确定关键位点，衍生物A8NO5能强效破坏细菌膜完整性并干扰核苷酸代谢，体外安全性良好，为其后续治疗开发奠定基础。论文发表在《生物有机化学》(Bioorganic Chemistry)。

研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：从NCBI基因组数据库获取红球菌属基因组序列并进行质量过滤；使用antiSMASH预测生物合成基因簇(BGC)，通过BiG-SCAPE在相似度阈值0.3下聚类为基因簇家族(GCF)并借助Cytoscape可视化；依据完整性、新颖性、长度等标准筛选候选NRPS BGC，结合PharmMapper进行潜在蛋白靶点预测，构建probable NRP类似物库；采用标准Fmoc固相肽合成协议化学合成肽类似物，以高效液相色谱(HPLC)和电喷雾电离质谱(ESI-MS)确证纯度与分子量；通过微量肉汤稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)；利用扫描电子显微镜(SEM)观察细菌形态，NPN（N-苯基-1-萘胺）法检测细胞壁渗透性，PI（碘化丙啶）摄取实验和核酸蛋白泄漏检测评估膜完整性破坏；采用非靶向代谢组学（UHPLC-Q Exactive HF-X系统）进行KEGG通路富集分析；通过CCK-8法评估细胞毒性，兔红细胞溶血实验评价溶血活性；并在新生牛血清和人血清存在下测定MIC变化以评估血清稳定性；补充次黄嘌呤(hypoxanthine)实验判断代谢变化是否直接靶标效应。

2.1. 红球菌属是丰富NRP的潜在储库

研究人员从NCBI获得913个标注为红球菌属基因组，经GTDBtk分类学确认仅21.84%真正属于红球菌属，其余为近缘属如Rhodococcus_F（39.85%）和Rhodococcoides（32.03%）；81.53%基因组为高质量（完整性≥90%）。用antiSMASH预测得到19270个BGC，BiG-SCAPE聚类为1099个GCF，其中61.06% GCF含≤10个BGC，显示多样性高；>80% GCF平均BGC长度>10000 bp，提示可能存在复杂次级代谢产物合成途径；34.40% BGC位于contig边缘致边界不完整。NRPS类GCF占全部GCF的64.15%（705个），表明红球菌属及其近缘属是NRPS相关AMP的重要化学储库；绝大多数不完整BGC为NRPS BGC（92%），后续分析需过滤不完整BGC。

2.2. 具有潜在抗菌活性的NRP筛选、合成与评价

研究人员用Cytoscape可视化NRPS GCF网络，每GCF选一个代表NRPS避免冗余；筛选标准包括GCF含BGC数量多、NRPS BGC完整且修饰基因少、antiSMASH预测NRP与已知NRP相似性<50%、NRP氨基酸残基≥4。因部分A结构域底物难以准确预测且无法判断线性或环化，研究人员对难预测位置选取多种结构多样性氨基酸，设计带有N端肉豆蔻酰（myristic acid）的线性NRP和头尾酰胺键环化NRP库；通过PharmMapper预测潜在蛋白靶点，从1099 GCF中选出33个BGC，构建297个probable NRP类似物库，化学合成16个潜在AMP（关联6个GCF：A8、A9、A13、A17、A27、A33）。抗菌测定仅A8–5-line（Myr-SLELSCSLQ，线性，第6位半胱氨酸，N端肉豆蔻酰）对表皮葡萄球菌有MIC=128 μg/ml，其余类似物MIC>256 μg/ml。

2.3. A8–5-line与A8NO5的构效关系(SAR)研究

研究人员对A8–5-line进行SAR：将第6位关键半胱氨酸替换为甲硫氨酸、天冬酰胺、色氨酸、酪氨酸等中性亲水氨基酸后活性丧失；去掉N端肉豆蔻酰（A8–5-2）活性丧失；换为联苯芳香酰基（A8–5-1）亦失活，表明脂肪族N-酰化取代基至关重要，且硫醇基团很可能为活性必需。为增强活性，研究人员在各位点进行氨基酸扫描（精氨酸带正电、谷氨酸负电、丙氨酸疏水、甲硫氨酸亲水），发现仅将C端谷氨酰胺替换为丙氨酸得到A8NO5（Myr-SLELSCSLA）使MIC从128降至42 μg/ml，且A8NO5对伪中间葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius) MIC=64 μg/ml，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CGMCC 1.821 MIC=128 μg/ml，耐药枯草芽孢杆菌CICC 25217 MIC=64 μg/ml；其余带电或亲水扫描均致失活。进一步A8NO5的SAR显示：C端丙氨酸替换为苯丙氨酸（A8NO5–1，MIC=64 μg/ml）或亮氨酸（A8NO5–2，MIC=128 μg/ml）仍保留活性，说明C端疏水性是关键；N端脂肪酰链从C14（肉豆蔻酰）改为C16（棕榈酰，A8NO5–3，MIC=64 μg/ml）活性维持，改为C10（癸酰，A8NO5–4）则失活，表明脂肪酰链长度也是活性决定因素。

2.4. A8NO5对表皮葡萄球菌细胞膜完整性的破坏

研究人员用扫描电镜(SEM)观察，DMSO对照组细胞呈正常球形且膜完整，A8NO5（2×MIC）处理组细胞表面塌陷皱缩，提示膜破坏和内容物丢失。核酸蛋白泄漏检测显示A8NO5（2×MIC处理2 h）使培养上清在OD_{260 nm}（核酸）和OD_{280 nm}（蛋白）吸收显著升高（P<0.001）。NPN摄取实验表明A8NO5（4×MIC，2 h）显著提高荧光强度（P<0.0001），说明细胞壁/膜渗透性增加。PI摄取实验显示A8NO5（4×MIC，2 h）荧光强度显著上升（P<0.001），表明膜损伤导致死细胞增多。综上A8NO5通过物理破坏膜完整性杀伤细菌，类似于达托霉素等作用模式，这种膜靶向机制使细菌较难产生耐药。

2.5. A8NO5引起的核苷酸代谢扰动

研究人员对A8NO5（2×MIC，2 h）处理组与失活类似物A8AC8（C端丙氨酸换为谷氨酸）对照组做代谢组学，PCA显示组间分离明显；差异代谢物（DEM）共634个（208上调，426下调）。KEGG富集最显著通路包括核苷酸代谢相关通路。脱氧肌苷、脱氧腺苷、次黄嘌呤（核苷酸补救合成途径底物）均显著下调（P<0.001），尿苷（关键核苷酸）也显著下调。次黄嘌呤补充实验显示外源次黄嘌呤不改变A8NO5的MIC，说明次黄嘌呤相关代谢下降并非直接靶标抑制效应，更可能是膜损伤及代谢崩溃的下游后果。

2.6. A8NO5体外细胞毒性和溶血活性

研究人员用CCK-8检测永生化人肝细胞，A8NO5在1/2×MIC和1×MIC时细胞存活率分别为91.1%和90.9%，2×MIC和4×MIC时略降至81.4%和71.7%，表明低细胞毒性。兔去纤维蛋白红细胞溶血实验显示即使4×MIC时溶血率仅4.29%（<5%非肝毒性标准），PBS阴性对照，Triton X-100阳性对照；说明A8NO5溶血活性可忽略，生物安全性良好。血清稳定性实验：1%新生牛血清下MIC升至128 μg/ml，10%时MIC>512 μg/ml；1%人血清下MIC升至256 μg/ml，10%时>512 μg/ml，提示A8NO5对血清成分（如蛋白酶降解、血清蛋白结合）敏感，但可通过材料递送策略改善稳定性与疗效。

讨论部分总结：随着抗生素耐药性全球危机加剧，亟需发现具新作用模式的AMP。NRP许多具优良抗菌活性，是临床有前景的AMP候选。本研究证明红球菌属及其近缘属富含NRPS，有开发NRPS相关AMP的潜力。基于生物信息学的无培养依赖syn-BNP发现策略是研究难培养微生物（如海洋微生物）基因组与宏基因组中NRPS BGC的高效途径。研究人员通过此策略结合SAR研究鉴定出对表皮葡萄球菌强效抑制的NRP类似物A8NO5；SAR揭示脂肪族N-酰化取代基和C端疏残基对其活性至关重要。机制研究表明A8NO5有效破坏细菌细胞膜并干扰表皮葡萄球菌核苷酸代谢，但代谢变化（如次黄嘌呤下降）很可能是膜损伤下游效应而非直接靶标特异性抑制；A8NO5在有效浓度下无明显细胞毒性和溶血活性，生物安全性良好。因此A8NO5有潜力作为新型先导抗菌化合物。研究结果可为从难培养微生物基因组和微生物群宏基因组中通过syn-BNP策略挖掘新抗生素并提供物质储备应对耐药危机提供指导。