多环吡啶酮衍生物的设计、合成及作为强效流感抑制剂的评价

《Bioorganic Chemistry》：Design, synthesis, and evaluation of polycyclic pyridone derivatives as potent influenza inhibitors

　　

尽管已有多种抗病毒药物获批，由流感病毒引起的大流行仍然是全球性的严重公共卫生问题，其中巴洛沙韦马布昔酯（baloxavir marboxil，BXM）作为首个帽依赖性核酸内切酶（cap-dependent endonuclease，CEN）抑制剂展现出卓越疗效。临床试验显示，BXM面临新出现的耐药性（例如I38T突变），这削弱了其对变异株的疗效，并促使研究人员开发更有效的抑制剂。在本研究中，通过将巴洛沙韦的二苯并硫杂卓（dibenzothiepin）骨架替换为二苯并环庚烯（dibenzocycloheptene），设计并合成了一系列新型取代的多环吡啶酮衍生物，以改善抗病毒活性并降低立体化学复杂性。先导化合物KJ001-12a对甲型和乙型流感病毒株均表现出强效的抗病毒活性。同时，分子对接和分子动力学模拟提供了支持性证据，表明具有二苯并环庚烯骨架的化合物可能受I38T突变诱导的疏水相互作用影响较小，这与细胞病变效应（cytopathic effect，CPE）测定的结果一致。相比之下，构效关系（structure-activity relationship，SAR）分析揭示，手性类似物需要进行手性拆分才能达到最佳疗效，并且在这些手性衍生物中R,S非对映异构体是活性最强的构型，尽管这些手性衍生物的活性相比非手性的KJ001-12a略有降低。流感聚合酶抑制活性测定和定量实时PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）测定证实，KJ001-12a显著抑制RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）的活性，并降低病毒M2 mRNA和vRNA的表达。此外，KJ001-12a在大鼠中表现出良好的生物利用度（F = 40.25%）和代谢稳定性，其药代动力学特征优于巴洛沙韦。这些发现凸显了KJ001-12a作为一个具有良好耐药性和药代动力学特性的有前景候选化合物，值得进一步开发。

# 多环吡啶酮衍生物作为强效流感抑制剂的研究解读

## 研究背景与目的

流感是由甲型和乙型流感病毒引起的高度传染性呼吸道疾病，每年导致约10亿例季节性感染，其中300-500万为重症。目前临床批准的流感药物主要包括M2离子通道抑制剂（如金刚烷胺、金刚乙胺）、神经氨酸酶（neuraminidase，NA）抑制剂（如扎那米韦、奥司他韦磷酸盐、帕拉米韦、拉尼米韦）、RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）抑制剂（如法匹拉韦）、PA亚基靶向抑制剂（如巴洛沙韦马布昔酯，BXM）及PB2亚基靶向抑制剂（如奥拉迪韦，Onradivir）。然而，流感病毒因基因组突变频繁产生耐药性，例如长期使用金刚烷胺和金刚乙胺已导致H₁N₁和H₃N₂耐药株出现，美国疾病控制与预防中心（CDC）已不再推荐这些药物。奥司他韦磷酸盐的广泛应用也导致耐药株增加。巴洛沙韦马布昔酯（BXM）是唯一上市的针对流感病毒PA/I38位点的核酸内切酶抑制剂，但I38T突变的出现已报道降低BXM敏感性，而BXM衍生物ZX-7101A也面临E18G突变导致的耐药问题。因此，迫切需要开发新型抗病毒药物以防控流感病毒感染。

RdRP是抗病毒研究的主要靶点，其PA亚基中的帽依赖性核酸内切酶（CEN）域在流感病毒的帽劫持（cap-snatching）机制中起关键作用，该域的双核金属中心（结合Mn²⁺或Mg²⁺）是BXM的作用靶点。尽管BXM是唯一有效上市的CEN抑制剂，但耐药株的出现以及绕开BXM相关专利和降低生产成本的需求，促使研究人员探索新型多环吡啶酮衍生物。本研究保留与CEN位点Mn²⁺配位的多环吡啶酮核心骨架，将巴洛沙韦的二苯并硫杂卓环替换为二苯并环庚烯环（基于前期工作显示该环同样能引发强效抗病毒活性），并进行生物电子等排替换和取代基修饰，旨在开发具有更高抗病毒活性、更低生产成本和更好生物利用度的新药物。

## 主要技术方法

研究人员采用有机合成化学方法，通过酯化、亲核取代、Gabriel合成、Suzuki偶联反应等构建目标化合物，并利用高效液相色谱（HPLC）和电子圆二色（ECD）光谱进行手性分离和绝对构型确定。生物学评价方面，以犬肾细胞（MDCK）为宿主，采用细胞病变效应（CPE）法和CCK-8法测定化合物的细胞毒性（TC₅₀）和半数抑制浓度（IC₅₀）；以293T细胞进行微小基因组报告基因检测评估对IAV-RdRP的抑制活性；运用定量实时PCR（qRT-PCR）检测病毒M2 mRNA和vRNA水平；使用重组流感病毒A/PR/8/34（WT和I38T突变株）评估抗突变能力；通过代谢稳定性实验（小鼠、大鼠、猴、人肝微粒体）和雄性SD大鼠体内药代动力学研究评价药代性质；采用分子对接（Schr?dinger Maestro，Glide XP模式）和分子动力学模拟（Gromacs 2022.3，100 ns）分析结合模式和抗突变机制。样本来源：MDCK细胞和所有流感病毒株均购自ATCC；SD大鼠来自商业供应商。

## 研究结果

### 化学合成

按照已报道方法路线，通过多步反应合成了目标化合物KJ001-12a~12l。其中，手性化合物经硅胶柱色谱初步分离，利用HPLC和ECD光谱确定构型，通过ECD计算（TDDFT方法）确认了KJ001-12i（R,R构型）和KJ001-12j（R,S构型）的绝对构型。

### 体外抗病毒活性

以MDCK细胞为宿主，通过CPE法评估所有化合物对甲型流感病毒A/PR/8/34（H₁N₁）株的抑制效力。KJ001-12a表现出接近巴洛沙韦的显著抗病毒活性（IC₅₀=1.96 nM，通过CPE评分），其效力比先导化合物KJ001-10a（IC₅₀=9.02 nM）高5倍以上。尽管KJ001-12a的细胞毒性稍高于KJ001-10a（TC₅₀=12.23 μM vs 22.99 μM），但其治疗指数（SI）显著改善（436.8 vs 55.4）。进一步采用CCK-8法验证，KJ001-12a对A/PR/8/34（IC₅₀=59.26 nM）、B/Massachusetts/2/2012（IC₅₀=55.45 nM）、A/California/07/2019(H₁N₁)pdm09（IC₅₀=15.56 nM）和A/California/2/2014（IC₅₀=15.77 nM）均具活性。在I38T突变株测试中，巴洛沙韦的耐药指数（RI）为30.86倍，而KJ001-12a仅为9.36倍，表明KJ001-12a对I38T突变引起的活性降低显著小于巴洛沙韦。

### qRT-PCR评估抗病毒活性

通过qRT-PCR分析，在0.2 nM浓度下，KJ001-12a使M2 mRNA水平显著降低76.72%，略低于同浓度巴洛沙韦的抑制效果。vRNA水平测定也显示KJ001-12a呈剂量依赖性抑制病毒复制。

### IAV-RdRP抑制实验

293T细胞中进行的IAV-RdRP抑制实验显示，目标化合物呈剂量依赖性抑制RdRP活性。在10 nM时，KJ001-12a和KJ001-10a的抑制率分别为45.6%和40.8%，接近巴洛沙韦的52.32%。此外，KJ001-12j（R,S构型）在20 nM时抑制率达54.0%，远高于R,R构型KJ001-12i的20.4%，证实R,S构型在IAV-RdRP水平上的优势。

### 代谢稳定性实验

KJ001-12a在人肝微粒体中半衰期（T_1/2）为697.38 min，内在清除率（Clint）为2.30 mL/min/kg，显著优于之前报道的KJ001-10a（14.49 mL/min/kg），且与巴洛沙韦（1.37 mL/min/kg）相当。

### 大鼠体内药代动力学

在雄性SD大鼠中单次给药实验显示，KJ001-12a的口服生物利用度（F%）为40.25%，是巴洛沙韦（11.72%）、巴洛沙韦马布昔酯（14.7%）和KJ001-10a（22.88%）的3.4倍、2.7倍和1.8倍，表明其具有更优的吸收效率或首过代谢稳定性。

### 分子对接与动力学模拟

分子对接显示KJ001-12a与PA核酸内切酶活性位点的结合模式与巴洛沙韦高度相似，二苯并环庚烯骨架占据与巴洛沙韦的二苯并硫杂卓核心几乎相同的空间位置。KJ001-12a中二氟取代引入保持了分子对称性，避免产生新手性中心，并通过增强与His41的π-π相互作用提高结合。分子动力学模拟（100 ns）表明，KJ001-12a与PA_N I38T突变体复合物达到稳定平衡，其结合紧凑性（SASA值）略优于巴洛沙韦，且自由能分解分析显示KJ001-12a与Thr38、His41、Lys122的结合贡献更强。二苯并环庚烯骨架可能不易受突变Thr38疏水相互作用影响，这与KJ001-12a较低的耐药指数一致。

## 总结与结论

研究人员总结：多环吡啶酮衍生物中，吗啉环上的氧原子对生物活性有显著影响（含吗啉部分的大多数化合物抗流感活性更高，结构-活性关系分析表明间位氟取代更适宜）。二苯并环庚烯骨架减少了对活性位点I38疏水相互作用的依赖，虽然活性略低于巴洛沙韦，但抗I38T突变的耐药指数显著改善。一致的非对映体偏好（R,S构型优于R,R）通过完全拆分的12g/12h对得到明确确认（R,R-12g IC₅₀=2060 nM；R,S-12h IC₅₀=690 nM）。手性拆分对临床推进不可或缺。结论部分翻译：KJ001-12a作为优化的流感PA抑制剂，对甲型（H₁N₁，IC₅₀=59.26 nM）和乙型（B/Massachusetts/2/2012，IC₅₀=55.45 nM）病毒株均显示出优于KJ001-10a的抗病毒活性。临床前研究中，KJ001-12a在人肝微粒体中具有延长的半衰期（T_1/2=697.38 min）和降低的内在清除率（Clint=2.30 mL/min/kg），大鼠口服生物利用度（40.25%）比巴洛沙韦（11.72%）高3.4倍。该研究提供了一种新型骨架作为流感抑制剂和对抗潜在耐药性（如I38T突变体）的替代方案，二苯并环庚烯骨架通过最小化手性中心简化了合成。KJ001-12a是一个具有改善耐药性和口服生物利用度的有前景的临床前候选药物，为解决当前抗流感疗法的局限性提供了潜在替代方案。未来研究将聚焦于体内药效验证，以及优化固态性质和药物制剂以促进临床研究。