《Cell Biomaterials》：Hybrid extracellular vesicles for targeted delivery of therapeutic cargoes to combat osteoporotic bone loss
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骨质疏松源于介导骨吸收的破骨细胞（osteoclasts）与介导骨形成的成骨细胞（osteoblasts）之间失衡，导致进行性骨丢失。研究人员通过将细胞外囊泡（EVs）与脂质纳米颗粒（LNPs）融合，构建了靶向骨组织的杂化囊泡，以实现互补治疗药物的协同递送。这
骨质疏松源于介导骨吸收的破骨细胞（osteoclasts）与介导骨形成的成骨细胞（osteoblasts）之间失衡，导致进行性骨丢失。研究人员通过将细胞外囊泡（EVs）与脂质纳米颗粒（LNPs）融合，构建了靶向骨组织的杂化囊泡，以实现互补治疗药物的协同递送。这些囊泡表面呈现并携带骨保护素（OPG）蛋白及其mRNA，并与负载腺苷（Ado）的纳米颗粒融合，形成同时负载OPG与Ado的EV-LNP（OPG-EV-LNP-Ado）。OPG作为核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的诱骗受体（decoy receptor），引导囊泡向骨组织的特异性靶向与摄取，增强了对成骨细胞的递送效果。全身给药后，该杂化囊泡在骨组织中优先积聚，并显著缓解骨质疏松病理，展示了一种用于靶向多载荷治疗以恢复骨稳态的模块化平台。
研究背景：骨质疏松是一种以进行性骨丢失和骨强度降低为特征的慢性骨骼疾病，其核心病理机制在于破骨细胞介导的骨吸收与成骨细胞（osteoblasts）介导的骨形成之间出现失衡。据估计，50岁以上人群中约三分之一的女性和五分之一的男性会遭遇与骨质疏松相关的骨折。随着人口老龄化加剧，脆性骨折及由此带来的失能调整生命年损失与社会经济负担日益沉重。目前临床常用的抗骨吸收药物如双膦酸盐，以及促骨形成药物如特立帕肽和罗莫苏单抗等，均存在一定局限性或不良反应。由于骨组织健康依赖于成骨与破骨活动的动态平衡，因此临床上亟需能够同时促进骨形成并有效抑制骨吸收的新型治疗策略。纳米递送技术的发展为骨靶向治疗提供了新的契机；然而，单一类型的递送载体往往难以同时装载多种性质迥异的治疗药物。为此，研究人员在《Cell Biomaterials》发表了这项研究，旨在开发一种可将多种载荷协同递送至骨组织的模块化载体，从而恢复骨稳态。
研究开展与意义：研究人员构建了一种由细胞外囊泡（EVs）与脂质纳米颗粒（LNPs）融合而成的杂化囊泡，用于将骨保护素（OPG）蛋白、OPG mRNA及小分子腺苷（Ado）共递送至骨组织。该设计的核心在于利用OPG作为核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的诱骗受体（decoy receptor），这一方面能够赋予囊泡向骨微环境靶向富集的能力，增强其被成骨细胞摄取的效率；另一方面可直接竞争性阻断RANKL与破骨细胞前体表面RANK受体的结合，从而抑制破骨细胞生成。同时，Ado作为小分子药物，具有促进成骨分化并抑制骨吸收的生物学功能。在卵巢切除（OVX）小鼠骨质疏松模型中，该杂化系统不仅显著提升了骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）和骨小梁数量（Tb. N），还改善了骨组织的力学性能，展现出联合多载荷治疗的重要临床潜力。
关键技术方法：此项研究所涉及的主要关键技术方法包括：通过Tnfrsf11b质粒转染使NIH3T3细胞过表达OPG以工程化制备EV，并采用纳米颗粒追踪分析（NTA）、免疫金标记透射电子显微镜（TEM）、酶联免疫吸附测定（ELISA）及荧光共振能量转移（FRET）分析对杂化囊泡进行表征；利用Cy5荧光标记结合活体成像系统（IVIS）评估骨靶向分布。在样本来源方面，体外实验使用自C57BL/6J小鼠分离的骨髓间充质基质细胞（BMMSC）及单核细胞（MNC）；体内实验以12周龄雌性C57BL/6J小鼠（Jackson Laboratory）构建OVX骨质疏松模型进行疗效评估，并以17周龄雌性C57BL/6J小鼠用于生物分布研究。研究通过micro-CT分析骨微结构参数，采用双荧光骨标记（calcein与alizarin）评估新骨形成，并借助四点弯曲实验检测胫骨力学性能。
研究结果：
- “Generation and characterization of OPG-functionalized EVs”：研究人员利用Tnfrsf11b质粒转染NIH3T3细胞，使其过表达OPG。RT-qPCR显示OPG mRNA表达量较对照增加约105倍，免疫荧光染色证实其蛋白水平升高。分离所得EV平均水动力直径约176 nm，Zeta电位约为?23.1 mV；ELISA检测显示EV中OPG蛋白含量显著升高。免疫金标记透射电子显微镜（TEM）进一步验证了OPG及典型外泌体标志物CD63、CD81和ALIX在囊泡表面的存在。
- “Preparation and characterization of hybrid vesicles”：采用冻融法结合膜挤出法将EV与LNP融合以制备杂化囊泡。纳米颗粒追踪分析（NTA）显示EV-LNP平均粒径约179 nm，Zeta电位介于单独的EV与LNP之间。荧光共振能量转移（FRET）分析显示，随着EV与LNP比例增加，供体荧光在535 nm处增强而受体荧光在580 nm处减弱，证实了两组分之间发生了有效的膜融合。体外细胞毒性实验表明，各组囊泡对骨髓间充质基质细胞（BMMSC）均无显著毒性。
- “Formation and characterization of Ado-loaded hybrid vesicles”：将负载Ado的LNP与前述OPG-EV融合构建OPG-EV-LNP-Ado，其Ado包封效率约210 μg/mg。体外成骨诱导分化实验显示，OPG-EV-LNP-Ado处理可上调BMMSC中Col1a1、Sp7及Ibsp等成骨标志物表达，并增强Alizarin Red S染色所示的矿化基质形成；而在由单核细胞（MNC）诱导分化的破骨细胞中，该囊泡显著下调Acp5、Nfkb1及Nfatc1等破骨标志物表达，并降低抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活性。
- “Enhanced accumulation of OPG-functionalized hybrid vesicles in bone tissue following systemic administration”：以Cy5标记的杂化囊泡经尾静脉注射入OVX小鼠，24小时后活体成像系统（IVIS）分析显示，OPG-EV-LNP组在椎骨和股骨中的荧光信号强度显著高于EV-LNP对照组，证明OPG功能化能够显著增强囊泡在骨组织中的靶向积聚。
- “Cellular uptake of hybrid vesicles and OPG mRNA overexpression”：OPG-EV-LNP被成骨细胞优先摄取，OPG mRNA表达量较对照组高约85倍；而BMMSC和破骨细胞的摄取量及OPG mRNA表达升高幅度明显较低。进一步研究表明，使用RANKL中和抗体可浓度依赖性地降低成骨细胞对该囊泡的摄取，证实该过程至少部分经由RANKL介导。
- “Hybrid vesicles containing OPG and Ado attenuate bone loss”：在OVX小鼠模型中，OPG-EV-LNP-Ado经过10周治疗后，micro-CT分析显示其骨密度（BMD）、骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量（Tb. N）和连接密度（Conn. D）显著增加，骨小梁间距（Tb. Sp）减小，且远端股骨呈现类似改善；TRAP染色显示破骨细胞数量与活性显著降低；双荧光骨标记实验显示骨矿化沉积率（MAR）和骨形成率（BFR）显著提升；四点弯曲力学测试表明胫骨的最大载荷和刚度均优于未治疗组。
讨论与结论：在讨论中，研究人员分析了该杂化平台的构成优势，指出其有效整合了EV的低免疫原性、生物相容性与固有组织归巢能力，以及LNP的高药物包封率与稳定性，从而实现了蛋白质、核酸与小分子药物在单一载体系统内的共递送。OPG蛋白扮演了双重角色：一方面作为RANKL的诱骗受体（decoy receptor），通过与骨微环境中高表达的RANKL结合，介导囊泡向骨组织的靶向定位；另一方面通过竞争性阻断RANKL/RANK信号通路，抑制过度破骨细胞分化。Ado则可通过激活腺苷A2B受体发挥促进成骨与抑制破骨的协同作用。尽管仅装载OPG的囊泡已表现出一定的骨参数改善趋势，但其效果在统计学上尚不显著；而当Ado与OPG协同递送后，各项骨形态与力学指标均出现显著改善，这充分凸显了多载荷联合治疗的优势。此外，近期针对骨质疏松患者的荟萃分析亦显示OPG/RANKL比值存在异常，进一步支持了通过调控该通路进行治疗的合理性。
总之，研究人员开发了经OPG功能化的骨靶向杂化囊泡，用于共递送OPG mRNA与Ado。通过整合LNP与EV两种系统，研究人员构建了一个可在单一纳米载体内递送结构迥异且作用机制不同治疗药物的杂化平台。不同载体在药物包封后融合的方式使杂化囊泡成为下一代联合疗法中一个多功能且强大的平台，尤其适用于需要多种治疗药物协同递送以增强疗效的临床场景。细胞摄取研究揭示了OPG功能化杂化囊泡在成骨细胞中的优先内化，并在骨相关细胞群体中验证了其生物活性。全身给药后，该工程化杂化囊泡表现出增强的体内骨组织定位。尤为重要的是，共负载OPG mRNA与Ado的杂化囊泡在骨质疏松小鼠模型中显著促进了新骨形成并缓解了骨丢失。除了良好的生物相容性与载荷能力，基于EV的纳米载体还兼具高效的细胞内递送及跨越生物屏障的潜力，凸显了其在联合药物递送领域的广阔前景。
