《Current Developments in Nutrition》：Potential Anticancer Effects of Limonene Associated with ROS Generation, Apoptosis Induction, and NF-κB Modulation in Papillary Renal Cell Carcinoma: A Preliminary Study
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背景：许多肾细胞癌（renal cell carcinoma, RCC）患者出现肿瘤复发和进展，凸显了对安全有效治疗方案的需求，特别是通过使用植物来源的生物活性化合物。柠檬烯（limonene）是一种常见于柑橘皮中的芳香单萜，已被证明在前列腺癌和膀胱癌等恶性肿
背景：许多肾细胞癌（renal cell carcinoma, RCC）患者出现肿瘤复发和进展，凸显了对安全有效治疗方案的需求，特别是通过使用植物来源的生物活性化合物。柠檬烯（limonene）是一种常见于柑橘皮中的芳香单萜，已被证明在前列腺癌和膀胱癌等恶性肿瘤中具有抗癌作用。本研究旨在探索柠檬烯对ACHN乳头状肾癌细胞（papillary renal cell carcinoma, pRCC）的潜在抗癌作用。
材料与方法：研究人员使用3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）法评估了经柠檬烯处理的ACHN细胞、人胚胎肾（HEK293）细胞和人真皮成纤维细胞（HDF）的活力。体外评估了细胞迁移、集落形成、3D球体发育、形态学改变以及caspase 3/7活性。通过流式细胞术分析了活性氧（reactive oxygen species, ROS）水平、凋亡和细胞周期改变。使用定量聚合酶链反应（quantitative polymerase chain reaction, qPCR）定量了BAX、BCL2、E-钙黏蛋白、N-钙黏蛋白、Caspase-3、Caspase-9、NF-κB、Akt1、MMP-2、MMP-9、mTOR、TNF-α、COX-2和IL-6的mRNA水平。通过蛋白质印迹法（Western blot）评估了NF-κB蛋白水平和IκB磷酸化。通过酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）测量了细胞核NF-κB水平。
结果：柠檬烯以剂量和时间依赖性方式降低ACHN细胞活力，对HEK293和HDF细胞的影响相对有限。柠檬烯显著降低了ACHN细胞的迁移、集落形成和球体生长。此外，柠檬烯升高了ACHN细胞的ROS水平并增加了凋亡，但不影响细胞周期进程。柠檬烯处理后，Akt1、mTOR、NF-κB、MMP-2、N-钙黏蛋白、BCL2、TNF-α、COX-2和IL-6的mRNA表达下降，而BAX和E-钙黏蛋白表达升高。Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平无显著改变，但caspase 3/7活性增加。柠檬烯还降低了NF-κB蛋白水平、IκB磷酸化和NF-κB核转位。
结论：这些初步的体外研究结果支持进一步在更多的pRCC模型中研究柠檬烯作为治疗候选药物的潜力。
肾细胞癌（renal cell carcinoma, RCC）是全球第14常见的恶性肿瘤，2022年新发病例约43.5万例，其中乳头状肾细胞癌（papillary RCC, pRCC）是第二常见亚型，占RCC病例的15%–20%。尽管手术切除（根治性或部分肾切除术）是局限性pRCC的标准疗法，但术后仍有20%–40%的患者出现疾病进展或复发。其他治疗方式（如冷冻消融、免疫检查点抑制剂及VEGFR抑制剂）常因耐药、免疫抑制或疗效有限而面临挑战。因此，开发安全、有效的新型治疗策略，特别是源自天然植物化合物的疗法，具有重要临床意义。柠檬烯（limonene）是一种广泛存在于柑橘皮中的芳香单萜，已在结肠癌、前列腺癌、膀胱癌等多种恶性肿瘤中展现出抗癌活性，但其对pRCC的作用尚未有报道。该论文发表在《Current Developments in Nutrition》，研究人员首次以pRCC的ACHN细胞系为模型，系统评估了柠檬烯的潜在抗癌效应及其分子机制，旨在为pRCC治疗提供候选化合物依据。
研究人员为开展本研究，主要使用了以下关键技术方法：细胞来源为伊朗巴斯德研究所的ACHN（人乳头状肾癌细胞）、HEK293（人胚肾细胞）及HDF（人真皮成纤维细胞）三种细胞系。通过MTT法（四唑盐比色法）测定细胞活力；划痕实验、集落形成实验和3D球体形成实验分别评估迁移、克隆原性和三维生长能力；流式细胞术检测活性氧（ROS）水平、凋亡率（Annexin V-FITC/PI双染）及细胞周期分布；定量PCR（qPCR）检测mRNA表达水平；Western blot检测NF-κB蛋白及IκB磷酸化；ELISA定量核内NF-κB含量。所有实验均设三次生物重复，采用t检验或单因素方差分析（ANOVA）进行统计学分析。
3.1 柠檬烯诱导ACHN细胞的细胞毒性和形态学改变：MTT结果显示，柠檬烯以剂量和时间依赖性方式降低ACHN细胞活力，24小时半数抑制浓度（IC
50）约为550 μM；对HEK293和HDF细胞的毒性显著低于ACHN细胞。结晶紫染色显示，柠檬烯处理后ACHN细胞出现变圆、皱缩等形态改变。
3.2 柠檬烯不改变细胞周期但抑制集落形成、3D生长和迁移：流式细胞术分析发现，柠檬烯处理组与对照组间各细胞周期时相比例无显著差异。集落形成实验显示，350 μM和550 μM柠檬烯分别使集落数减少77.9%和96.7%。球体形成实验中，两种浓度分别使球体体积减小29.4%和36.9%。划痕实验表明，350 μM柠檬烯处理24小时可抑制ACHN细胞迁移能力达85.2%。qPCR进一步揭示，柠檬烯上调E-钙黏蛋白（E-cadherin）mRNA表达2.8倍，下调N-钙黏蛋白（N-cadherin）81.6%、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）61.9%及基质金属蛋白酶-9（MMP-9）83.2%。
3.3 柠檬烯升高细胞内ROS并促进凋亡：DCFDA染色后流式细胞术显示，柠檬烯使ACHN细胞内ROS水平升高45.8%。Annexin V/PI染色发现凋亡率从3.52%升至18.83%。qPCR结果表明，促凋亡基因BAX mRNA上调6倍，抗凋亡基因BCL2下调78.3%；Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平无显著变化，但caspase 3/7活性增加42.71%。
3.4 柠檬烯下调Akt、mTOR和NF-κB表达并抑制IκB磷酸化：qPCR显示，柠檬烯使Akt1、mTOR和NF-κB mRNA分别降低47.7%、36%和73.9%。Western blot证实NF-κB总蛋白水平下降约16%，IκB磷酸化水平下降54.7%。ELISA检测发现核内NF-κB含量减少35.2%。此外，NF-κB下游靶基因（MMP-9、BCL2、TNF-α、COX-2、IL-6）的mRNA表达均显著下降。
讨论部分总结：研究人员指出，柠檬烯对ACHN细胞的抗癌作用主要涉及ROS升高、凋亡激活以及上皮-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）相关基因的调节。与既往在膀胱癌、前列腺癌等研究一致，柠檬烯有效抑制迁移和MMP表达。值得注意的是，尽管Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平未变，但caspase 3/7活性上升，提示柠檬烯可能通过翻译后激活（如蛋白水解切割）而非转录调控促进凋亡。细胞周期无显著改变，因此集落和球体生长的抑制可能主要源于凋亡而非增殖阻滞。NF-κB通路方面，柠檬烯显著降低IκB磷酸化及核转位，进而抑制下游促癌基因转录，提示其作用机制主要在于阻断NF-κB活化而非单纯降低总蛋白水平。局限性包括：仅使用一种pRCC细胞系（ACHN），未来需在ccRCC细胞系（如Caki-2、786-O）及体内动物模型中验证，并探索其药代动力学及生物利用度。
研究结论：综上所述，这项初步的体外研究表明，柠檬烯能降低ACHN细胞活力、克隆原性生长、球体形成及伤口闭合能力，同时增加ROS积累和凋亡。柠檬烯处理还与IκB磷酸化减少、核内NF-κB水平降低以及NF-κB应答基因表达下降相关。这些发现为未来将柠檬烯作为pRCC治疗候选物进行评估提供了初步基础。
