综述：动态视角下的戊型肝炎病毒衣壳：与杯状病毒的结构相似性及差异

《Current Opinion in Virology》：The HEV capsid through a dynamic lens: parallels and divergence from caliciviruses

　　

戊型肝炎病毒（HEV）衣壳蛋白pORF2介导病毒粒子组装、附着与入侵，但其分子机制尚未明确。结构生物学研究已解析pORF2病毒样颗粒的高分辨率结构，揭示其整体架构与杯状病毒VP1蛋白高度相似。杯状病毒衣壳动态性已被证实存在环境触发构象转换，可调控受体结合、脱壳及免疫逃逸，但HEV是否具备类似构象可塑性仍待探索。同时，尽管已有多项研究鉴定pORF2与宿主因子的潜在相互作用，但尚未确定其功能性受体。本综述系统梳理pORF2的结构特征、存在形式及宿主互作网络，并与杯状病毒衣壳动态行为的已有研究进行对比。以“动态衣壳”视角审视HEV，可为病毒入侵生物学中若干未解问题提供新思路，包括pORF2如何与宿主因子互作、准包膜与非包膜颗粒的功能差异，以及肠道至肝脏转运过程中的环境信号是否调控衣壳构象。若要验证HEV是否像杯状病毒近亲一样利用衣壳动态性建立感染，整合结构生物学、生物物理学及细胞水平研究将是关键路径。

引言

戊型肝炎病毒（HEV）属于戊肝病毒科（Hepeviridae）帕斯拉肝炎病毒属（Paslahepevirus），为正链单股RNA病毒。目前已鉴定出8种基因型，其中HEV1-4为主要人类病原体，HEV1/2仅感染人类，HEV3/4以动物（尤其是猪）为储存宿主。自2018年起，大鼠HEV（Rocahepevirus ratti）被报道可跨物种感染人类，虽属不同病毒种，但仍具公共卫生意义。HEV是全球急性病毒性肝炎最常见的病因，每年新增感染约2000万例。多数感染者呈急性自限性病程，但在孕妇及免疫功能低下人群中可进展为慢性肝炎、严重肝外疾病或暴发性肝炎。感染者体内同时存在粪便排出的非包膜颗粒与血清中的准包膜颗粒。HEV基因组包含3个开放阅读框，ORF1编码复制相关非结构蛋白，ORF2编码衣壳蛋白pORF2，ORF3编码蛋白参与准包膜颗粒的出胞过程。pORF2的N端信号肽将其导向分泌途径，产生糖基化分泌型蛋白；而内部起始密码子启动的翻译则产生胞质型pORF2，进一步组装为病毒衣壳。分泌型糖基化pORF2被认为可作为中和抗体的免疫诱饵，衣壳结合型pORF2则介导病毒组装与入侵。HEV治疗手段有限，利巴韦林可清除慢性感染但存在不良反应，现有疫苗Hecolin仅在少数国家获批。近期从康复者体内分离的高效中和抗体为治疗提供了新方向。HEV曾因分类学特征被归入杯状病毒科（Caliciviridae），后基于系统发育分析独立成科。两类病毒均为二十面体对称、主要经粪口传播，且主要衣壳蛋白pORF2与VP1在结构上高度相似。杯状病毒VP1已被证实具有高度动态性，可通过构象转换调控受体结合、免疫逃逸与脱壳，而HEV衣壳的结构研究虽较充分，其动态行为却几乎未被探索。本文所述“衣壳动态性”指病毒衣壳蛋白响应环境信号或配体结合，发生可逆且具有功能意义的构象变化的能力。本文将系统总结pORF2的结构特征、存在形式及附着因子研究进展，并与杯状病毒VP1动态性的丰富研究成果对比，提出HEV结构生物学的核心问题不仅在于鉴定受体与宿主因子，更在于明确pORF2及衣壳本身是否为动态实体，其构象可塑性是否与病毒入侵及后续感染过程偶联。目前缺乏pORF2或衣壳与附着因子、受体互作的结构信息，难以判断HEV是否具备杯状病毒所证实的衣壳动态性。尽管两者感染过程存在差异，杯状病毒仍为思考HEV衣壳可塑性提供了重要概念框架，或可启发新的研究假说与实验方向。

戊型肝炎病毒衣壳蛋白pORF2

2009年首次解析的病毒样颗粒（VLP）晶体结构显示，全长660个氨基酸的pORF2折叠为三个结构域：形成连续二十面体支架的壳体（S）域、位于S域上方的中央（M）域，以及向外突出的突出（P）域。P域通过富含脯氨酸的长铰链区与M域连接，赋予其灵活性并形成特征性的P域二聚体交叉拓扑。P域单独即可介导二聚化，P-P与P-M相互作用共同稳定二聚体刺突结构。pORF2存在3个潜在N-糖基化位点（N137、N310、N562），其中N137与N310位于S域，在组装的VLP中埋于亚基界面；N562位于P域顶端，处于推测的受体结合表位区域。早期研究认为全长ORF2翻译产物直接组装为衣壳，近十年研究证实HEV可产生多种功能不同的pORF2形式。N端信号肽引导的分泌型糖蛋白进入内质网与分泌途径，该形式高度糖基化（包括N562位点），可能遮蔽受体结合表面同时保留中和表位，发挥抗体诱饵功能。信号肽下游内部起始密码子启动的翻译产生胞质型pORF2，其在组装过程中发生N端与C端截短，末端约163个残基的去除是VLP形成的必要条件。此外，感染细胞与患者血清中还鉴定出第三种pORF2，同样为糖基化分泌形式，分子量小于前述分泌型，可能源于蛋白酶加工，其功能尚不明确，推测或可暴露其他分泌型pORF2无法展示的表位，作为免疫诱饵发挥作用。除组装与抗原性外，近期研究显示pORF2还可拮抗细胞固有抗病毒应答，促进细胞培养中的持续复制，进一步扩展了其功能谱系。非包膜病毒表面的pORF2负责附着与入侵，但经典的高亲和力入侵受体尚未被鉴定。初步低亲和力附着被认为由硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）介导，后续生化与感染实验提出了多个候选受体，包括葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、视黄醇结合蛋白4（RBP4）、去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）、ATP合酶β（ATP5B）、整合素α3（ITGA3）、整合素β1（ITGB1）及表皮生长因子受体（EGFR），但这些因子的确切作用仍需验证。非包膜病毒的后续内化依赖发动蛋白2、网格蛋白及胆固醇的内吞途径。入侵后，热休克蛋白90（HSP90）及组织蛋白酶L参与病毒运输与pORF2加工。与之不同，准包膜HEV采用独立的入侵途径，绕过初始衣壳-受体结合步骤，进入细胞后被转运至溶酶体，Rab5与Rab7 GTP酶介导准包膜破裂，释放衣壳。

杯状病毒VP1及其动态性

杯状病毒科已成为衣壳动态性研究的模式系统。VP1组装为T=3二十面体颗粒，由180个拷贝组成。VP1包含保守的S域（形成封闭二十面体支架）与突出P域，后者进一步分为P1与P2亚结构域。P1构成刺突基部，结构与HEV M域同源；P2位于远端，携带受体结合位点与主要中和表位，对应HEV P域。S域与P1之间通过柔性铰链连接，与HEV M域和P域之间的富含脯氨酸铰链类似。杯状病毒VP1可介导多样的受体与共因子互作：猫杯状病毒（FCV）VP1结合猫连接黏附分子1（fJAM-1），人诺如病毒（HuNoV）衣壳结合组织-血型抗原（HBGAs），小鼠诺如病毒（MNV）以CD300lf为受体，且HuNoV与MNV均利用胆汁酸作为共因子调控感染力与受体结合。此前基于生物学实验推测MNV与HuNoV可结合唾液聚糖，但生理条件下的核磁共振（NMR）实验证实二者VP1均不结合唾液聚糖，且MNV也不结合HBGAs。杯状病毒VP1的核心特征之一是可至少采取两种构象状态，常被称为“静息态”与“抬高态”。静息态中P域靠近衣壳，铰链压缩，见于多种HuNoV、札如病毒及圣米格尔海狮病毒结构。抬高态中P域通过伸展的铰链升高并旋转于衣壳上方，见于特定HuNoV基因型、MNV、FCV及兔出血症病毒。最初这些构象被认为是毒株特异性的静态特征，但高分辨率冷冻电镜研究显示单个衣壳可在环境触发下动态转换于两种状态之间，且该转换具有明确功能后果。在MNV中，P域的运动可调控CD300lf受体结合位点与中和表位的暴露。鉴于杯状病毒与HEV衣壳的结构相似性，推测HEV衣壳也可能具备类似动态性。Lewis等总结了杯状病毒衣壳的“呼吸”现象如何介导多属病毒的附着、脱壳与免疫逃逸。在FCV中，受体结合诱导P2域发生剧烈局部重排，形成类似门户的开口，容纳多聚VP2组装。VP2形成漏斗状结构，其融合肽插入内体膜，促进脱壳与基因组释放。综上，杯状病毒VP1是一个动态分子机器，其构象可塑性与感染过程紧密偶联。

VP1动态性的环境调控及对戊型肝炎病毒的启示

VP1的构象状态受胃肠道环境中多种因子调控。二价金属离子（如Ca²⁺、Mg²⁺、Cd²⁺）结合于P域二聚体内部位点，可稳定静息态并遮蔽中和表位。NMR研究显示Mg²⁺与Ca²⁺在MNV P域的结合与胆汁酸甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）存在协同效应，而GII.4型HuNoV P域未检测到二者结合，但Zn²⁺与Cd²⁺可结合P域二聚体。GII.4型HuNoV衣壳的冷冻电镜研究在A/B与C/C二聚体的两个组氨酸残基（H460）之间鉴定到Cd²⁺结合口袋，且EDTA处理可影响衣壳直径，提示存在金属离子结合。MNV经EDTA处理后VP1向抬高态转变，且该过程可被重新添加离子逆转。这类环境驱动的构象变化被认为可促进肠道内的受体结合。由于HEV传播途径相似，推测其可能存在类似机制，但仍需实验验证。衣壳柔性也受pH调控。MNV VLP在无稳定离子的碱性条件下倾向于抬高态，酸性条件则有利于静息态。HuNoV衣壳的纳米压痕研究显示，pH升高导致颗粒膨胀、机械稳定性下降，与P域抬高一致。生理背景下，这一特征具有合理性：病毒经口感染后首先进入胃部，酸性环境下衣壳收缩为静息态，可保护病毒免受恶劣环境影响；随后转运至肠道，pH升高触发衣壳抬高，允许受体结合及跨越肠上皮。推测HEV在从肠道向肝脏转运过程中可能经历类似过程，但需借助杯状病毒研究中应用的结构生物学工具寻找证据。HuNoV中GCDCA结合于P域二聚体顶端附近位点，可介导特定毒株的HBGA结合；MNV中GCDCA结合于二聚体中央口袋，稳定静息态与二聚体，并促进CD300lf结合。毒力与减毒MNV毒株对pH与胆汁酸的敏感性存在差异，将衣壳动态性与致腹泻潜能联系起来。这些观察结果支持如下模型：诺如病毒经胃肠道入侵时，低pH、金属离子与胆汁酸共同作用，将衣壳收缩为肠道中具有受体结合能力的静息态，同时调控表位暴露以逃逸预存抗体。HEV传播途径相似，同样面临相同的理化梯度。现有研究显示HEV3病毒粒子在pH 2至9范围内保持感染性，但未检测pORF2是否存在pH依赖性构象变化。目前认为胆汁酸仅用于剥离HEV准包膜，其与衣壳的直接结合及构象效应尚未被考虑。两类病毒衣壳结构域组织与环境暴露特征的相似性提示，pORF2也可能响应pH、离子或胆汁酸采样不同构象状态，但该假设尚待实验证实。

讨论

过去二十年的杯状病毒研究已将衣壳认知从静态外壳转变为动态实体，其构象可塑性支撑病毒感染的关键步骤。VP1在静息态与抬高态之间转换，在受体与共因子结合时发生局部重构，并与VP2等次要衣壳蛋白协同驱动膜穿透与基因组释放。这些转换受病毒行进路径中遭遇的环境信号精准调控，包括pH、金属离子、胆汁酸及其他共因子与宿主受体。HEV虽不属于杯状病毒科，但衣壳架构与之高度相关。pORF2的结构生物学研究已取得快速进展，目前已有VLP、截短P/E2s域及P域-抗体复合物的高分辨率结构，且分泌型、衣壳结合型及其他加工形式的pORF2已被明确鉴定。然而这些研究大多是在有限条件下获得的静态快照，天然病毒粒子的结构仍未知，且尚无证据表明pORF2是否发生类似杯状病毒VP1的构象转换，例如在准包膜与非包膜状态之间，或响应肠道至肝脏转运过程中的胆汁酸与pH变化。尽管HEV与杯状病毒衣壳存在结构相似性，部分特征限制了二者的直接比较。杯状病毒的衣壳动态性与依赖特定受体的入侵途径及VP2介导的脱壳过程相偶联，而HEV无同源蛋白；且HEV的明确入侵受体尚未被鉴定，衣壳动态性研究缺乏关键受体组分；此外准包膜HEV通过独立途径入侵，绕过非包膜HEV的入侵通路，衣壳动态性在此类颗粒中的作用（若存在）进一步增加了比较的复杂性。因此，应将杯状病毒作为提出HEV衣壳科学问题的参考框架，而非直接模型。Zheng等鉴定的单克隆抗体8C11结合于HEV P域的侧翼表位，将其建模至完整VLP时，结合模式会与邻近pORF2二聚体的M域产生严重空间位阻，Fab片段无物理结合空间。进一步分析显示，8C11结合可逐步破坏突出刺突，约2小时内导致颗粒近乎完全解离，揭示了一种不同于经典受体结合位点阻断的碰撞驱动中和机制。后续研究证实另一抗体8H3与8C11存在单向协同效应：8H3结合于P域顶端表位，与8C11位点相邻，两个Fab直接相互作用并在二聚体上相互稳定。8H3单独不引起颗粒不稳定，但可放大8C11的破坏效应。这些研究共同揭示了P-M界面的机械弱点，提示pORF2在多价配体结合时可发生大规模构象破坏。类比推测，空间排列相似的受体-共受体对可能在入侵过程中触发衣壳不稳定，促进感染细胞内的脱壳。HEV细胞培养模型的近期进展为相关研究提供了实验系统，优化的肝癌细胞与极化肝样细胞系可支持更高滴度的感染，并产生非包膜与准包膜病毒粒子，为在生理相关条件下研究天然衣壳及pORF2构象如何受宿主因子（如HSPGs、候选受体）、pORF3介导的准包膜化及环境参数调控提供了可能。将杯状病毒“动态衣壳”框架应用于HEV可提出多个具体研究方向：一是对不同pH、离子浓度及胆汁酸条件下的HEV颗粒进行冷冻电镜分析，最好结合已鉴定的中和抗体，以揭示pORF2是否存在多种构象及表位暴露是否受调控；X射线晶体学与宿主因子或受体（一旦被鉴定）的复合物结构可提供静态重排信息，补充冷冻电镜可能获得的多状态图像。二是采用氢氘交换质谱、NMR或单分子荧光共振能量转移（smFRET）等生物物理方法研究P域构建体，验证是否存在类似VP1的局部灵活性与配体诱导构象变化。pORF2因分子量较大对蛋白NMR具有挑战性，可尝试采用配体NMR光谱检测潜在附着因子与HEV VLP的结合，该方法已在兔出血症病毒VLP研究中得到验证。smFRET的最大挑战是在缺乏已知受体的情况下将距离变化与生物学相关转换关联。三是系统绘制候选受体与附着因子的结合位点，明确是否像MNV-CD300lf互作一样需要动态“呼吸”过程。四是明确构象状态是否与不同功能角色对应，包括准包膜与非包膜病毒粒子、分泌型诱饵ORF2及细胞内形式。未来研究需重点关注所用系统的生物学相关性。天然病毒粒子是最理想的研究对象，但目前难以大量获取，亟需细胞培养模型的进一步优化。VLP是最佳替代物，但产量低且存在T=1与T=3两种形式，增加了研究复杂度。衣壳二聚体最易制备与操作，但生理学相关性最低。除技术挑战外，HEV领域既往研究优先关注流行病学、疫苗开发与治疗策略，包括重组VLP疫苗研发、利巴韦林治疗方案及近期的高效中和抗体，相对而言对衣壳生物物理与动态特性的高分辨率解析投入较少。尽管取得上述进展，pORF2介导入侵与脱壳的机制仍不明确，凸显了结构知识、治疗开发与机制理解之间的差距。以下关键问题仍未得到解答：HEV衣壳在完整病毒粒子中是否存在多种构象状态？宿主因子（包括中和抗体或候选受体）的相互作用是否会诱导相应结构重排？准包膜与非包膜HEV颗粒的衣壳构象与稳定性是否存在差异？pORF2的哪些区域是入侵与脱壳过程中的构象弱点？更广泛地说，衣壳动态性是否是HEV入侵的普遍原则？综上，HEV衣壳蛋白是抗病毒策略与疫苗研发的重要靶点。借鉴杯状病毒VP1的研究成果，不应再将pORF2视为静态支架，而应重视衣壳动态性在入侵、脱壳与免疫逃逸中的作用。将这一概念框架应用于HEV研究，有望揭示pORF2生物学中此前未被认识的特征，推动结构研究与机制研究超越静态模型，最终阐明HEV建立感染的动态过程。