整合网络药理学、分子对接和实验验证以阐明桦木醇治疗糖尿病神经病变的功能机制

《Current Research in Biotechnology》：Integrating network pharmacology, molecular docking, and experimental validation to elucidate the functional mechanism of Betulin in treating diabetic neuropathy

　　

桦木醇（Betulin, BET）是一种天然存在的三萜类化合物，主要存在于桦木属（Betula）树皮中。尽管已证明其具有抗糖尿病和神经保护特性，但其缓解糖尿病神经病变（diabetic neuropathy, DN）的潜在机制尚不清楚。本研究通过结合网络药理学、分子对接和实验验证的综合策略，在喂食高脂饮食/链脲佐菌素（HFD/STZ）诱导的DN大鼠模型中，评估了BET（40 mg/kg）的治疗效果。抗氧化能力通过ORAC（AUC: BET为15.54，优于Trolox的12.06）和CAP-e测试（IC₅₀: 17.22 ± 0.39 μg/mL）进行评估。BET对α-淀粉酶表现出混合竞争性抑制（IC₅₀ 44.64 ± 1.25 μg/mL），对α-葡萄糖苷酶表现出竞争性抑制（9.52 ± 0.70 μg/mL）。BET对乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase, AChE）（0.93 ± 0.12 μg/mL）和丁酰胆碱酯酶（butyrylcholinesterase, BChE）（5.02 ± 0.52 μg/mL）活性表现出强效抑制。BET改善了高血糖、肝功能和血脂异常的标志物。它还改善了氧化和炎症标志物，增加了胆碱酯酶和脑源性神经营养因子（BDNF）水平，减少了Aβ42聚集，抑制了异常MAP-τ磷酸化，降低了BACE1表达，并提高了DN大鼠中的ATP1A3水平。组织学检查显示DN大鼠的胰腺组织完整性和神经元细胞形态得到改善。网络药理学揭示了BET与DN之间的67个潜在靶点，如EGFR、STAT3、ESR1、MTOR、GSK3B、NFKB1、HSP90AA1、JAK2、PTGS2、ACHE、BCHE、INSR、NTRK1和VEGF（在蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络中）。KEGG分析揭示了胰岛素抵抗（IR）、AGE-RAGE、PI3K-Akt和胰岛素信号通路。BET与致病靶点之间具有强结合亲和力（AChE: ?7.1 kcal/mol, BChE: ?10.4 kcal/mol, TNF-α: ?8.6 kcal/mol, IL-6: ?7.0 kcal/mol, hs-CRP: ?7.3 kcal/mol, BACE1: ?8.2 kcal/mol, Atp1a3: ?7.3 kcal/mol）。BET通过其三萜骨架（在C-3和C-28位点含有OH基团）提供的抗氧化能力，对抗了高血糖诱导的氧化应激，改善了神经递质，缓解了神经肽和炎症，从而在DN大鼠中发挥作用。

糖尿病神经病变（DN）是糖尿病常见的微血管并发症，主要由高血糖引发的氧化应激、线粒体功能障碍和炎症导致神经损伤，但目前常规治疗方法存在副作用大、疗效有限等问题。天然化合物桦木醇（BET）虽已知具有抗糖尿病和神经保护活性，但其治疗DN的具体机制尚未阐明。为此，研究人员在《Current Research in Biotechnology》发表论文，采用网络药理学、分子对接与体内实验相结合的综合策略，在HFD/STZ诱导的DN大鼠模型中系统探究BET的治疗潜力。研究证实BET通过三萜骨架C-3和C-28位点的羟基提供强抗氧化能力，可改善高血糖、胰岛素抵抗、脂代谢紊乱、氧化应激和神经炎症，并恢复神经递质及保护神经元结构，为DN的综合管理提供了候选药物。

本研究采用的关键技术方法包括：通过ORAC（氧自由基吸收能力）和CAP-e（细胞基红细胞抗氧化保护）实验评估抗氧化能力；利用酶抑制动力学分析BET对α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶及胆碱酯酶的抑制模式；运用网络药理学（借助SuperPred、GeneCards、STRING等数据库）预测BET与DN的共有靶点并进行PPI（蛋白质-蛋白质相互作用）网络构建及KEGG通路富集分析；采用AutoDock Vina进行分子对接验证结合亲和力；在Wistar大鼠（来源于印度国家科学教育与研究所以及区域植物资源中心动物设施）HFD/STZ诱导的DN模型中进行血清生化、氧化应激、炎症因子及神经标志物检测，并结合组织病理学观察。

研究结果如下：
**ORAC和CAP-e实验**：ORAC显示BET的净AUC为15.54，优于Trolox的12.06；CAP-e实验显示BET的IC₅₀为17.22 ± 0.39 μg/mL，低于没食子酸（27.53 ± 0.88 μg/mL），表明BET具有强抗氧化能力，归因于C-3和C-28位羟基的供氢能力。
**α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性**：BET对α-淀粉酶（IC₅₀ 44.64 ± 1.25 μg/mL）和α-葡萄糖苷酶（IC₅₀ 9.52 ± 0.70 μg/mL）均显著抑制，动力学分析显示前者为混合竞争性抑制，后者为竞争性抑制，提示其可延缓碳水化合物消化、控制餐后血糖。
**胆碱酯酶抑制实验**：BET对AChE和BChE的IC₅₀分别为0.93 ± 0.12 μg/mL和5.02 ± 0.52 μg/mL，强于对照药加兰他敏（24.29和23.14 μg/mL），表明其具有神经保护潜力。
**网络药理学分析**：共鉴定出67个BET与DN的共同靶点，核心枢纽包括EGFR、STAT3、ESR1、MTOR、GSK3B、NFKB1等；KEGG富集显示主要涉及IR、AGE-RAGE、PI3K-Akt及胰岛素信号通路，提示BET通过多通路调控发挥治疗作用。
**分子对接**：BET与TNF-α（?8.6 kcal/mol）、IL-6（?7.0 kcal/mol）、hs-CRP（?7.3 kcal/mol）、AChE（?7.1 kcal/mol）、BChE（?10.4 kcal/mol）、BACE1（?8.2 kcal/mol）及Atp1a3（?7.3 kcal/mol）均显示强亲和力，支持其调控炎症和神经退行性靶点的潜力。
**血清标志物生化检测**：BET显著降低SG、HOMA-IR、HbA1C、AST、ALT、ALP、TB、TG、TC、LDL-C水平，升高SI和HDL-C，改善肝功能和血脂异常。
**氧化应激标志物**：BET降低肝脏、胰腺和大脑中的MDA水平，升高SOD、CAT和GSH活性，减轻氧化损伤。
**炎症标志物**：BET显著降低TNF-α、IL-6和hs-CRP在肝脏、胰腺和大脑中的水平，抑制炎症反应。
**神经参数**：BET降低AChE、BChE活性及BACE1表达，减少Aβ42聚集，抑制MAP-τ异常磷酸化，升高BDNF和Atp1a3水平，改善神经递质和神经元功能。
**组织病理学**：H&E染色显示BET恢复大脑皮层神经元和胶质细胞形态，改善胰腺胰岛细胞结构完整性。

讨论部分总结指出，BET通过其三萜骨架（C-3和C-28的OH基团）的强抗氧化能力，协同调控氧化应激（Nrf2/HO-1通路）、炎症（NF-κB通路）、代谢（PI3K-Akt、IR通路）及神经退行性（BACE1、MAP-τ、Aβ42）等交叉通路，从而在多靶点层面缓解DN。研究结论翻译如下：本研究通过整合体内实验、网络药理学与分子对接，全面揭示了BET在HFD/STZ诱导DN大鼠中的多效作用机制。BET表现出优于Trolox的氧自由基吸收能力和与没食子酸相当的红细胞保护活性，并通过对α-淀粉酶（混合竞争性）和α-葡萄糖苷酶（竞争性）的抑制支持血糖控制，其抗胆碱酯酶活性（优于加兰他敏）提示神经保护潜力。在DN模型中，BET有效改善高血糖、胰岛素抵抗、肝功能障碍和血脂异常；通过降低MDA、增强内源性抗氧化酶（SOD、CAT、GSH）恢复氧化平衡，同时抑制肝脏、胰腺和皮层中的TNF-α、IL-6和hs-CRP。BET通过升高胆碱酯酶和BDNF水平、减少Aβ42聚集、抑制MAP-τ磷酸化及下调BACE1表达发挥神经保护作用，并上调坐骨神经ATP1A3支持神经元完整性。组织学结果进一步证实了胰腺和神经元组织结构的改善。网络药理学鉴定了BET与DN间的67个潜在靶点（包括EGFR、STAT3、ESR1、MTOR等），KEGG通路分析突出IR、AGE-RAGE、PI3K-Akt和胰岛素信号通路。分子对接确认BET与炎症、神经退行性和代谢调控关键靶点（AChE、BChE、TNF-α、IL-6、hs-CRP、BACE1、Atp1a3）具有强结合亲和力（?7.0至?10.4 kcal/mol）。综上，BET主要通过其三萜骨架C-3和C-28位羟基的强抗氧化能力，靶向DN中氧化应激、炎症、代谢紊乱和神经退行性交叉通路发挥多效作用，是DN及伴随神经退行性并发症综合管理的候选药物，未来需进一步改善其生物利用度并探索协同制剂。