《Current Research in Toxicology》：Downregulation of lactosylceramide synthases B4GALT5 or B4GALT6 alters glycosphingolipid profiles and enhances oxaliplatin sensitivity in colon cancer cells
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糖鞘脂（glycosphingolipids, GSLs）是一类重要的生物活性脂质，既作为膜的结构成分，也作为信号分子参与调控多种生物过程，例如细胞生长和细胞死亡的控制。它们在结肠癌细胞中的显著失调表明其在疾病进展中的潜在作用。乳糖神经酰胺（lactosylc
糖鞘脂（glycosphingolipids, GSLs）是一类重要的生物活性脂质，既作为膜的结构成分，也作为信号分子参与调控多种生物过程，例如细胞生长和细胞死亡的控制。它们在结肠癌细胞中的显著失调表明其在疾病进展中的潜在作用。乳糖神经酰胺（lactosylceramide, LacCer）是GSL代谢中的关键中间体，也是更复杂GSL的重要前体。在此，研究人员研究了抑制LacCer合成（通过CRISPR/Cas9介导的基因敲低选择性靶向特异性乳糖神经酰胺合酶（lactosylceramide synthases, LCS），B4GALT5或B4GALT6）对人DLD-1结肠腺癌细胞增殖、死亡和化学敏感性的影响。所选酶的下调（通过各自mRNA和蛋白质水平的降低验证）显著降低了LCS敲低细胞中LacCers及几种更复杂GSL（特别是GM3和GM1a神经节苷脂）的水平。重要的是，这增强了DLD-1细胞对奥沙利铂（oxaliplatin，一种常用于结直肠癌治疗的化疗药物）细胞毒性作用的敏感性。这通过细胞活力普遍下降、凋亡细胞死亡增强、caspase-8、-9、-3的裂解/激活以及caspase底物的裂解得以证实。研究人员还观察到内质网应激反应的调节，特别是在奥沙利铂处理的LCS敲低细胞中ATF6水平降低。当前发现支持LCS在调节结肠癌细胞对化疗药物（如奥沙利铂）作用敏感性中的功能作用，并对铂类药物在癌细胞中毒性作用的机制可能具有进一步意义。
**论文解读文章**
**研究背景、问题与目的**
结直肠癌（colorectal cancer, CRC）是全球第三大常见癌症和第二大癌症死亡原因，晚期预后差且治疗抵抗是主要挑战。糖鞘脂（glycosphingolipids, GSLs）作为生物活性脂质，参与细胞信号传导、膜动力学和细胞间通讯，其生物合成始于内质网（endoplasmic reticulum, ER）中神经酰胺（ceramide, Cer）的形成，随后在高尔基体（Golgi apparatus, GA）中通过糖基转移酶逐步糖基化。乳糖神经酰胺（lactosylceramide, LacCer）是GSL代谢的关键中间体，由乳糖神经酰胺合酶（LCS）家族中的B4GALT5和B4GALT6两种亚型合成。已有研究表明，CRC发展过程中脂质代谢的显著变化可能促进疾病进展，GSLs可调节癌症标志性特征，包括细胞增殖、存活、免疫逃逸和转移。此外，GSL合成在凋亡抵抗中发挥作用，例如B4GALT5水平升高与白血病细胞耐药表型相关。LacCer的前体葡萄糖神经酰胺（GlcCer）在结肠癌细胞对奥沙利铂（oxaliplatin，一种铂类化疗药物，常用于CRC治疗，包括FOLFOX方案）的耐药中起重要作用。然而，LCS在CRC化疗敏感性中的作用尚不明确。研究人员前期在CRC患者肿瘤样本中观察到LacCer物种显著升高，且B4GALT5和B4GALT6表达上调，提示抑制LacCer合成可能是克服耐药性的潜在靶点。本研究旨在通过下调B4GALT5或B4GALT6，探究其对结肠癌细胞增殖、死亡及奥沙利铂敏感性的影响。
**研究内容、结论与意义**
研究人员利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建B4GALT5或B4GALT6敲低（knockdown, KD）的DLD-1人结肠腺癌细胞模型，通过高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）分析GSL和鞘脂（sphingolipids, SLs）谱变化，并评估细胞增殖、细胞周期、凋亡及内质网应激标志物。结果发现，B4GALT5或B4GALT6的下调显著降低LacCer及复杂GSL（如GM3、GM1a和GA2）水平，但不显著影响细胞增殖或细胞周期分布。然而，这两种KD均增强奥沙利铂诱导的细胞毒性，表现为细胞活力下降、凋亡增加、caspase-8/-9/-3裂解/激活及PARP裂解增强，并伴随内质网应激标志物ATF6水平降低。结论表明，下调LCS可通过增强caspase依赖性凋亡和内质网应激调节，提高结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性，揭示了GSL代谢在化疗敏感性调控中的潜在作用，为CRC治疗新策略提供依据。该论文发表在《Current Research in Toxicology》。
**主要关键技术方法**
研究人员采用CRISPR/Cas9介导的基因敲低技术，通过靶向B4GALT5或B4GALT6基因外显子的gRNA转染DLD-1细胞（来源于美国模式培养物保藏中心），经单细胞分选和测序验证获得稳定KD克隆。运用RT-qPCR和Western blotting验证mRNA和蛋白水平。使用HPLC-MS/MS定量分析鞘脂和糖鞘脂种类。细胞活力通过刃天青（resazurin）测定，凋亡通过Annexin V/PI染色和流式细胞术检测，caspase-3裂解通过FITC标记抗体流式分析及Western blotting评估，内质网应激标志物（CHOP、BiP、ATF4、ATF6）通过RT-qPCR和Western blotting检测。统计分析采用线性模型和beta回归模型。
**研究结果**
**3.1 DLD-1结肠癌细胞中B4GALT5或B4GALT6抑制模型的表征**：通过CRISPR/Cas9成功获得B4GALT5 KD和B4GALT6 KD克隆，mRNA和蛋白水平显著降低（图1）。HPLC-MS/MS分析显示，两种KD均显著降低所有LacCer物种（C16:0至C24:1）及GM1a、GA2水平；B4GALT5 KD还降低GM3水平，而GD3和硫苷脂水平未变，总Cer水平仅轻微变化（图2）。结果表明成功建立LCS敲低模型，导致LacCer及其部分产物下调。
**3.2 B4GALT5和B4GALT6 KD对DLD-1细胞增殖和细胞周期进程影响不大**：96小时培养期内，两种KD细胞的细胞数量与对照相比无显著差异（图3A）；仅B4GALT6 KD细胞在G1和G2/M期有微小变化，S期无显著改变（图3B）。提示LCS下调不影响细胞生长特性。
**3.3 表达B4GALT5或B4GALT6降低的DLD-1细胞对奥沙利铂细胞毒性更敏感**：刃天青试验显示，25 μM奥沙利铂处理72小时后，B4GALT5 KD细胞活力显著降低；50 μM时两种KD细胞活力均下降（图4A）。据此选用50 μM进行后续实验。
**3.4 奥沙利铂诱导的凋亡在B4GALT5或B4GALT6表达降低的DLD-1细胞中增强**：Annexin V/PI试验表明，奥沙利铂处理后KD细胞中死细胞和凋亡细胞比例增加（图4B, C）。流式细胞术和Western blotting显示KD细胞中裂解caspase-3阳性细胞比例增加（图4D, E），且caspase-3、caspase-9、caspase-8和PARP裂解增强（图5），证实凋亡途径激活。
**3.5 奥沙利铂处理的B4GALT5或B4GALT6 KD DLD-1细胞内质网应激标志物水平变化**：RT-qPCR和Western blotting显示，奥沙利铂处理后CHOP mRNA和蛋白水平在KD和对照细胞中类似增加，BiP蛋白水平类似下降，而ATF6蛋白水平在KD细胞中更显著降低（图6）。提示ATF6可能参与增强的化疗敏感性。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究验证了LCS下调可显著增强结肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性，主要通过caspase依赖性凋亡和内质网应激调节（尤其ATF6降低）。与先前药理学抑制GlcCer合成增强化疗敏感性的研究一致，但本研究首次聚焦LCS。结论部分翻译如下：“在这里，研究人员发现两种重要的LacCer合成酶B4GALT5或B4GALT6的下调，主要通过增强caspase依赖性凋亡，并伴随内质网应激反应的调节，显著提高了结肠癌细胞对常用于CRC治疗的药物奥沙利铂细胞毒性作用的敏感性。综上所述，这些数据强调了GSL代谢在调节结肠癌细胞化疗敏感性中的作用，支持其作为进一步研究的有前景靶点的潜力。”
