精细单细胞谱分析捕获多发性硬化中CCR5highCD4+细胞毒性T细胞前体

《eBioMedicine》：Refined single-cell profiling captures a CCR5high CD4+ cytotoxic T-cell precursor in multiple sclerosis

　　

摘要：背景——数十年的免疫学与遗传学研究强调CD4+T细胞是发生多发性硬化（Multiple Sclerosis, MS）个体中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）病变的启动因素。一种低频CD4+T细胞群被称为Th17.1（T helper 17.1）细胞，因其丰度差异被认为在MS起病阶段起核心作用，但其功能异质性及在MS中独特的作用模式知之甚少。方法——研究人员利用全光谱流式细胞术（spectral flow cytometry）探索外周血中区分Th17.1与Th17及Th1细胞的特征；通过分析配对的外周血与脑脊液（Cerebrospinal Fluid, CSF）以及那他珠单抗（natalizumab）治疗前后外周血，聚焦MS中Th17.1的脑归巢特性；对分选的纯化亚群进行单细胞转录组学分析及相应的体外（in vitro）刺激实验，进一步分析鉴定出的Th17.1效应特征。发现——筛选显示存在一个CCR5highTh17.1簇，该簇在CSF中富集，且在MS患者接受那他珠单抗治疗后外周血中选择性减少；该Th17.1簇的表型与转录特征匹配并指向高度应答及前细胞毒性状态；CCR5highTh17.1细胞通过强效响应IL-12上调细胞毒性蛋白，而仅在同时加入IL-12与IL-18时才会分泌这些蛋白。解读——研究人员表明，循环的低频Th17.1细胞包含一个独特的MS相关CCR5high簇，具有增强的细胞毒性及CNS浸润潜能；这种CD4+细胞毒性T细胞前体可作为未来研究中监测MS疾病相关免疫扰动以实现精准医疗的有前景靶点。

《eBioMedicine》刊载的该研究围绕多发性硬化（Multiple Sclerosis, MS）中Th17.1细胞的功能异质性展开。研究背景方面，MS是年轻成人常见的神经致残性疾病，现有证据认为CD4⁺T细胞是最先突破血脑屏障（Blood–Brain Barrier, BBB）并启动中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）局部炎症的淋巴细胞，其中低频的Th17.1（T helper 17.1）细胞被认为是潜在致病亚群——既往研究发现Th17.1是唯一能在体外穿过非炎症状态下BBB的CD4⁺效应T细胞，且在未治疗MS患者CSF中富集、受那他珠单抗（natalizumab, NTZ；抗VLA-4抗体，可阻断免疫细胞向CNS迁移）治疗影响而在外周血中滞留，但Th17.1内部的功能异质性及其在MS中的效应程序仍不清楚，因此本研究旨在明确Th17.1细胞中驱动MS病理的特异性亚群及其特征。研究人员通过全光谱流式细胞术、配对MS患者外周血与脑脊液（Cerebrospinal Fluid, CSF）样本分析、那他珠单抗治疗前后配对血样比较、分选纯化Th17.1亚群进行单细胞RNA测序（single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq）及体外细胞因子刺激实验，发现Th17.1细胞中存在一个CCR5^high独特亚群，该亚群在MS患者CSF中富集、那他珠单抗治疗后外周血中减少，具备脑归巢分子特征及前细胞毒性状态，可经IL-12诱导细胞毒性蛋白表达并经IL-12+IL-18协同触发其分泌，且条件培养基可破坏体外BBB模型完整性，证实其为具CNS浸润潜能的CD4⁺细胞毒性T细胞前体，有望成为MS疾病活动监测的生物标志物及治疗靶点。

主要关键技术方法：采集健康供体外周血、未治疗MS患者配对外周血与CSF、MS患者那他珠单抗治疗前后配对外周血及健康供体白细胞单采物来源PBMC（Peripheral Blood Mononuclear Cell, 外周血单个核细胞），分选记忆CD4⁺T细胞及Th1(CCR6^–CXCR3⁺CCR4^–)、Th17(CCR6⁺CXCR3^–CCR4⁺)、Th17.1(CCR6⁺CXCR3⁺CCR4^–)亚群；采用全光谱流式细胞术检测表面及胞内分子；对分选Th17.1细胞进行10× Genomics 5′ scRNA-seq并结合HTO（Hash Tag Oligonucleotide, 哈希标签寡核苷酸）去混库、Seurat进行整合聚类与差异表达分析、scRepertoire进行T细胞受体（T Cell Receptor, TCR）克隆型分析；进行短时IL-12刺激检测STAT4磷酸化、长时IL-12/IL-18刺激检测表型与胞内细胞毒性分子及上清Luminex/ELISA检测分泌因子；采用人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3通过电阻抗传感（Electric Cell-substrate Impedance Sensing, ECIS）检测跨内皮电阻（Transendothelial Electrical Resistance, TEER）评估BBB完整性及MTS法检测内皮细胞活力。

研究结果如下：

光谱流式筛选揭示Th17.1细胞具有独特的CCR5关联效应表型

研究人员对健康供体PBMC进行37参数全光谱流式检测，对比Th17、Th17.1、Th1细胞表面分子表达，发现Th17.1细胞中CCR2、CXCR6、KLRB1（CD161）、c-KIT、CD26（DPP4）、IL-18Rα（Interleukin-18 Receptor α）、IL-7Rα及CCR5阳性率显著高于Th17和Th1；进一步将Th17.1按CCR5表达分为CCR5^neg、CCR5^dim、CCR5^high亚组，发现CCR5^high亚组显著高表达CCR2、KLRB1、KLRG1、CD26、IL-18Rα、CXCR6（不伴c-KIT/IL-7Rα/CXCR4升高），说明Th17.1内部存在以CCR5^high为标志、共表达脑归巢与活化受体的独特效应表型。

CCR5^highTh17.1细胞的效应表型在MS患者CSF中更为显著

研究人员分析15例未治疗MS患者配对外周血与CSF，发现CSF来源Th17.1细胞CCR5⁺频率及CCR5荧光强度均高于外周血，CCR5^high/CCR5^dim比值在CSF Th17.1中约为外周血的2倍；CSF中CCR5^highTh17.1同样高表达CD26、IL-18Rα、CXCR6、CCR2、KLRB1及胞内颗粒酶K（Granzyme K, GZMK），证实CCR5^highTh17.1亚群倾向于向CNS归巢并在炎症部位富集。

那他珠单抗降低MS中具有高度应答及前细胞毒性状态的CCR5^highTh17.1细胞

研究人员分析8例MS患者那他珠单抗治疗前后配对血样，发现那他珠单抗治疗后Th17.1总量在外周血滞留增加，但其中CCR5^high亚群比例选择性下降；scRNA-seq对治疗前后分选Th17.1细胞测序后聚为7个簇，簇2高表达CCR5、CCR2、CXCR6、GZMK及细胞毒性相关基因（GZMA、PRF1穿孔素、CX3CR1）、IL-12/IL-18信号基因（IL12RB2、IL18R1、IL18RAP），且该簇在那他珠单抗治疗后频率显著降低；TCR克隆型分析显示患者优势克隆主要分布于簇2，提示该CCR5^high簇是具抗原经验、向CNS迁移及前细胞毒性特征的Th17.1效应亚群。

Th17.1细胞通过对IL-12和IL-18的偏好性应答获得CCR5关联效应表型

研究人员对分选健康供体Th1/Th17/Th17.1进行体外刺激，发现Th17.1（尤CCR5⁺亚群）短时IL-12刺激后p-STAT4（磷酸化Signal Transducer and Activator of Transcription 4）水平及阳性率高于Th17和Th1；长时IL-12上调Th17.1细胞CCR5、IL-18Rα及CXCR6表达（Th1/Th17不明显），IL-12+IL-18共刺激进一步上调CXCR6及细胞毒性相关表面分子GPR56（Adhesion G Protein-coupled Receptor G1, ADGRG1）、CX3CR1（Fractalkine Receptor），说明CCR5⁺Th17.1对IL-12/IL-18信号有独特敏感性并可被极化为细胞毒性前体。

IL-12与IL-18协同驱动CCR5⁺Th17.1细胞分泌细胞溶解蛋白

研究人员检测体外刺激后胞内及上清分子，发现IL-12可诱导CCR5⁺Th17.1上调胞内颗粒酶A（Granzyme A, GZMA）、颗粒酶B（Granzyme B, GZMB）及穿孔素（Perforin, PRF1）并下调GZMK，IL-18单独无此作用，但IL-12+IL-18共刺激能协同促进GZMA/GZMB/PRF分泌至上清（Th1/Th17无此协同分泌效应）；Th17.1经IL-12+IL-18刺激后的条件培养基可显著降低hCMEC/D3单层TEER并轻度降低内皮活力，证明该亚群激活后分泌的效应分子可破坏BBB完整性。

讨论部分总结：研究人员通过整合单细胞谱分析在Th17.1细胞中鉴定出一个MS相关的CCR5^high簇，该簇共表达CCR2、CXCR6、CD26、IL-18Rα、KLRB1及GZMK，在MS患者CSF中富集、那他珠单抗治疗后外周血中减少，说明其具备向CNS归巢能力；该亚群高表达IL-12RB2与IL-18R，体外经IL-12诱导胞内细胞毒性蛋白表达、IL-12+IL-18协同促其分泌并损伤BBB模型，代表一种循环中的CD4⁺细胞毒性T细胞前体。CD26可剪切CCL5生成偏好结合CCR5的异构体从而促进CCR5⁺T细胞CNS归巢，CXCR6配体CXCL16在炎症CNS中由星形胶质细胞等表达，亦支持其脑趋向性。MS易感基因TYK2、STAT4、SH2B3参与IL-12信号通路，EB病毒（Epstein–Barr Virus, EBV）感染B细胞产生IL-12/IL-18可能促使Th17.1向细胞毒性偏移。局限性在于未直接在MS脑实质中验证该亚群存在及功能，未来需在死后脑组织中对CCR5^highTh17.1进行原位表征，并探究其与B细胞/小胶质细胞互作及对MS相关抗原的应答，该前体有望作为MS疾病活动生物标志物及精准干预靶点。

研究结论翻译：本研究表明，通过整合单细胞谱分析可鉴别人循环中低频Th17.1 CD4⁺T细胞内的一个独特MS相关CCR5^high簇，该簇具有获得细胞毒性表型及进入CNS的倾向；其在CSF中选择性富集且受高效药物那他珠单抗抑制，定位该CCR5^highTh17.1细胞为一种循环CD4⁺细胞毒性T细胞前体，可进一步评估其在炎性CNS内的作用，并用于更早检测及更精准监测MS治疗反应。