《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Single-nuclei transcriptomics provides insights into cellular heterogeneity and communications in the glacial relict Hucho bleekeri under heat exposure
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由全球变暖和工业热污染引起的水温上升正威胁野生和养殖鱼类的生存，这已成为国际水产养殖的核心关注点之一。理解鱼类对热暴露的生理和行为响应对于提高其生存能力至关重要。然而，多数研究依赖组织水平的整体组学分析，未能揭示细胞异质性。在本研究中，研究人员应用超微结构观察
由全球变暖和工业热污染引起的水温上升正威胁野生和养殖鱼类的生存，这已成为国际水产养殖的核心关注点之一。理解鱼类对热暴露的生理和行为响应对于提高其生存能力至关重要。然而，多数研究依赖组织水平的整体组学分析，未能揭示细胞异质性。在本研究中，研究人员应用超微结构观察和单核RNA测序（snRNA-seq）系统研究了急性热胁迫下川陕哲罗鲑（Hucho bleekeri）的生理变化及机制。组织学分析显示，热胁迫后鳃出现局灶性出血和鳃小片断裂。超微结构观察表明，热暴露后鳃上皮细胞脱落，且扁平细胞和富线粒体细胞中的细胞器形态受损。snRNA-seq对鳃的分析生成了28个细胞簇，每簇细胞数范围为129至5590。热胁迫后，上皮细胞（GobC）和内皮细胞比例显著下降，而中性粒细胞比例显著上升。具体而言，细胞比例变化和伪时间分析提示热胁迫期间发生了内皮-间质转化，且炎症相关基因表达沿伪时间轴增加。差异表达基因（DEGs）分析显示，热休克蛋白和血红蛋白家族基因在多数细胞类型中上调，而每种细胞也呈现特定的DEGs谱。转录因子分析揭示，热胁迫后多数细胞类型中CEBPD、JUNB和CEBPA的活性增强。细胞通讯分析显示，热胁迫后出现了CXCL12A–CXCR4B以及CLDN11A–CLDN11A的相互作用。此外，通过实时定量PCR和荧光原位杂交分析验证了snRNA-seq的结果。本研究为川陕哲罗鲑响应热胁迫的细胞异质性和生理变化提供了见解，并为未来研究环境胁迫对鲑科鱼类影响的机制奠定了基础。
**研究背景与意义**
由全球变暖和工业热污染引起的水温上升正对野生和养殖鱼类构成严重威胁。作为变温动物，鱼类体温随环境水温变化，热胁迫（heat stress）会深刻影响其生理、代谢和行为。以往研究多依赖组织水平的传统组学（bulk-omics）方法，如组织学、生化分析、转录组学、蛋白质组学或代谢组学，但这些方法无法揭示特定细胞类型中的基因表达变化，难以阐明细胞水平的异质性和细胞间通讯。川陕哲罗鲑（Hucho bleekeri）是长江上游的旗舰物种和顶级捕食者，具有维系水生生态系统平衡的重要作用。作为第四纪冰川期南迁后被困于陆地的孑遗物种，它在鲑科鱼类中分布于最低纬度，是唯一在青藏高原存活的鲑科鱼类，其高原环境可能赋予其独特的适应模式，是研究鲑科鱼类环境适应进化的理想模型。然而，目前缺乏关于温度胁迫对川陕哲罗鲑影响及其在高温胁迫下如何响应和调控生理功能的研究。本研究通过超微结构观察和单核RNA测序（snRNA-seq），系统探索了热胁迫下鳃的病理和超微结构变化，并从单细胞水平解析基因表达模式、转录因子调控和细胞通讯，旨在阐明川陕哲罗鲑热胁迫的分子响应模式，为鲑科鱼类环境胁迫机制研究和耐高温品种筛选提供数据基础。该论文发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》。
**主要关键技术方法**
研究人员使用了扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）进行超微结构观察；采用10× Genomics平台进行单核RNA测序（snRNA-seq），样本来自六尾雌性人工繁殖F1个体（体重1287.2±55.1 g，体长45.9±0.3 cm），分为对照组（15±1°C）和热胁迫组（每小时升温1°C至23±1°C，持续24 h）。通过Cell Ranger进行数据质控和比对，利用Harmony整合数据并校正批次效应，t检验分析细胞比例差异；Monocle2进行伪时间轨迹分析；SCENIC分析转录因子（TF）活性；CellChat分析细胞通讯。通过实时定量PCR（real-time PCR）和荧光原位杂交（FISH）验证关键结果。
**研究结果**
**3.1 热胁迫后鳃的组织病理学变化**
通过苏木精-伊红染色发现，对照组鳃结构正常，高温胁迫后鳃出现轻度局灶性出血、大量鳃小片断裂及长度不均，表明热胁迫严重破坏川陕哲罗鲑鳃的正常结构。
**3.2 鳃的超微结构变化**
SEM显示热胁迫后鳃上皮细胞脱落并肿胀，上皮细胞间微嵴模糊不清。TEM显示富线粒体细胞中染色质丢失、电子密度降低、核周间隙增宽，线粒体肿胀、嵴断裂溶解，粗面内质网扩张，胞质内管状系统减少；扁平细胞中核不规则、染色质部分丢失，线粒体肿胀，部分粗面内质网轻度扩张。
**3.3 单核测序数据质量**
六份样本平均产生332,961,257条读段，有效条形码平均达94.7%，经质控后每样本平均细胞数6643个，有效细胞率93.78%，共生成28个细胞簇，细胞数129~5590个。
**3.4 川陕哲罗鲑鳃的单细胞图谱**
鉴定出上皮细胞（扁平细胞、基底细胞、离子细胞、杯状细胞、簇细胞、神经上皮细胞等）、免疫细胞（T细胞、B细胞、浆细胞、中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞）、内皮细胞、红细胞、基质细胞（成纤维细胞、平滑肌细胞）及增殖细胞。扁平细胞为最丰富类型，表达CLDN4、CLDN8等标记基因。
**3.5 热胁迫后细胞比例变化**
杯状细胞（GobC）比例显著下降，中性粒细胞比例显著上升，内皮细胞比例显著下降。伪时间分析显示内皮细胞可分化为成纤维细胞，提示内皮-间质转化（EndMT）发生，且沿伪时间轴炎症相关基因表达增加。
**3.6 热胁迫下不同细胞类型基因表达变化的异同**
在簇细胞、神经上皮细胞、离子细胞、扁平细胞、杯状细胞、红细胞、T细胞、浆细胞、巨噬细胞和中性粒细胞中分别鉴定出681、574、1078、942、765、254、505、636、799和437个上调基因。KEGG富集分析显示，T细胞和扁平细胞中差异基因富集于抗原加工呈递、内质网蛋白质加工等通路；红细胞中富集于核糖体通路。所有细胞共享138个差异基因，HSP家族基因在多数细胞类型中上调（如HSP70、HSP90A1），而每种细胞也有特异性差异基因（如离子细胞中FOX家族基因上调，簇细胞中SLC转运蛋白基因上调）。
**3.7 热胁迫下转录因子差异分析**
鉴定出7个转录因子（IRF1、GATA3、ATF2、ATF4、CEBPD、JUNB、CEBPA）及其形成的10个调控子。热胁迫后，CEBPD、JUNB（extended）和CEBPA（extended）在巨噬细胞、树突状细胞、扁平细胞、簇细胞、杯状细胞、中性粒细胞、内皮细胞、初始B细胞和成纤维细胞中活性增强。
**3.8 细胞通讯分析**
鉴定出5863个显著相互作用类型。内皮细胞、树突状细胞和巨噬细胞拥有最丰富的配体-受体对。热胁迫后，cDC2的差异配体-受体对数变化最大，APPA–CD74A、APPA–CD74B等配体-受体对在胁迫组中通讯概率升高。ESAM、MIF、SELE、LIGHT、CLDN和CXCL六条通路在热胁迫组中通讯强度显著增加，其中CXCL12A–CXCR4B和CLDN11A–CLDN11A仅在热胁迫后出现通讯。
**3.9 snRNA-seq结果验证**
实时定量PCR验证了HSP70、HSP90A1、HBB、HBA等共有差异基因的表达趋势与测序一致。FISH验证了簇细胞标记基因（C11ORF53、TPH5、AVIL、SOX8）共定位，并鉴定出鳃中一簇共表达B细胞标记BLNK、经典树突状细胞标记FLT3及哺乳动物浆细胞样树突状细胞标记TCF4和IRF8的独特树突状细胞。
**总结讨论**
研究人员在讨论中指出，热胁迫导致鳃组织结构严重破坏（局灶性出血、鳃小片断裂、上皮细胞脱落等），与尼罗罗非鱼、梭鲈等研究一致，损害呼吸和渗透调节功能。中性粒细胞比例上升可能与细胞损伤释放的促炎信号有关，杯状细胞比例下降可能与上皮细胞脱落和凋亡有关。内皮细胞比例下降伴随成纤维细胞增加，结合内皮细胞表达MGP、FN1等EndMT标志基因，提示热胁迫促进内皮-间质转化，TGF-β表达沿伪时间轴升高。HSP家族基因在多数细胞中普遍上调（HSP70、HSP90A1等），血红蛋白基因HBB、HBA上调可能为对抗氧化胁迫的反馈机制。免疫细胞中特异上调免疫调节基因，簇细胞中SLC转运蛋白上调可能维持能量代谢和离子平衡，离子细胞中FOX家族基因改变影响细胞命运。转录因子CEBPD、JUNB和CEBPA活性增强，参与氧化应激和JNK通路响应。细胞通讯中CXCL12A–CXCR4B和CLDN11A–CLDN11A仅在热胁迫后出现，可能参与免疫细胞募集和鳃上皮屏障调节。研究提供了耐热鲑科品种筛选的潜在分子标记（如HSP70、HSP90），并为川陕哲罗鲑的栖息地保护和人工繁殖管理提供依据，但局限性包括仅用雌性个体、未进行功能验证、未在野生群体验证等。
**研究结论翻译**：
本研究首次在单细胞分辨率下系统表征了川陕哲罗鲑的热胁迫响应。研究人员证明，急性热胁迫诱导了严重的鳃结构损伤，特征为上皮细胞脱落、线粒体功能障碍和局灶性出血。单核测序揭示杯状细胞和内皮细胞比例减少，中性粒细胞比例增加。热胁迫后，HSP和血红蛋白家族基因在所有细胞中几乎均上调，而每种细胞也呈现独特的差异表达基因集。转录因子分析显示，热胁迫后巨噬细胞、树突状细胞、扁平细胞、簇细胞、杯状细胞、中性粒细胞、内皮细胞、初始B细胞和成纤维细胞中CEBPD、JUNB（extended）和CEBPA（extended）活性增强。细胞通讯配体-受体富集通路发现，ESAM、MIF、SELE、LIGHT、CLDN和CXCL的通路通讯强度在热胁迫组显著增加。本研究全面揭示了川陕哲罗鲑应对热胁迫的机制，为研究其他鲑科鱼类在高温挑战下的生理响应提供了基准。
