暴露于聚苯乙烯微塑料和纳米塑料的厌氧颗粒污泥（AnGS）的对比毒性效应与恢复潜力：粒径和表面功能化的调节作用

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Contrasting toxic effects and recovery potential of AnGS exposed to polystyrene micro- and nanoplastics: Modulating roles of particle size and surface functionalization

　　

厌氧氨氧化（Anammox）系统是高度敏感的生物脱氮过程，然而，暴露于不同表面功能化的微/纳米塑料的厌氧颗粒污泥（AnGS）的急性效应和恢复潜力仍未被充分理解。本研究系统调查了在12小时暴露和12小时恢复期内，暴露于聚苯乙烯微塑料（PS-MP）、原始聚苯乙烯纳米塑料（PS-NP）以及表面功能化聚苯乙烯纳米塑料（PS-NH₂和PS-COOH）的AnGS的急性毒性效应和短期恢复反应。结果表明，PS-MNPs的毒性受粒径和表面功能化的共同影响，抑制强度顺序为PS-NH₂ > PS-NP > PS-MP > PS-COOH。PS-NH₂对脱氮性能造成最强抑制，并在测试的恢复期内表现出不完全恢复，伴随显著的氧化应激。蛋白质二级结构分析进一步表明，PS-NH₂诱导了紧密结合型胞外聚合物（TB-EPS）层中蛋白质的显著构象扰动，表现为α-螺旋比例降低和聚集链比例增加。相比之下，PS-COOH导致大量胞外聚合物（EPS）蛋白质损失，但功能抑制相对较弱，表明仅凭EPS数量无法完全解释AnGS功能的恢复。恢复结果进一步表明，蛋白质构象完整性可能比总蛋白质含量对恢复系统功能更为重要。总体而言，本研究揭示了PS-MNPs对AnGS的毒性涉及生物应激和EPS结构扰动，为评估基于Anammox的废水处理系统中微/纳米塑料的生态风险提供了分子水平的视角。

**论文解读：聚苯乙烯微纳米塑料对厌氧颗粒污泥的对比毒性效应与恢复潜力——粒径与表面功能化的调节作用**

**研究背景与科学问题**

全球塑料污染问题日益严峻，塑料废弃物在环境中经物理磨损、光化学降解和生物作用等过程，逐步破碎为微塑料（MPs，1 μm–5 mm）和纳米塑料（NPs，1–1000 nm）。与MPs相比，NPs具有更小的粒径、更高的比表面积和更活跃的表面特性，其环境行为和生物效应不能简单从较大塑料颗粒外推。在复杂水生态系统中，NPs表面会吸附天然有机质和无机胶体等形成生态冠（ecocorona），掩盖其原始表面性质并改变其胶体稳定性、迁移性及生物可利用性与毒性途径。NPs可穿过生物屏障进入细胞，通过催化产生活性氧（ROS）诱导氧化应激，导致脂质过氧化、DNA损伤和蛋白质变性。废水处理厂（WWTPs）是微纳米塑料（MNPs）的重要汇和潜在源，而厌氧氨氧化（Anammox）工艺作为一种高效节能的生物脱氮技术，依赖生长缓慢且敏感的厌氧氨氧化细菌（AnAOB）。AnAOB的活性及胞外聚合物（EPS）保护层的稳定性对系统性能至关重要，但MNPs可能干扰微生物群落、损伤EPS结构并影响脱氮效率。然而，不同表面功能化NPs对Anammox系统EPS的分子和结构影响，尤其是蛋白质二级结构及应激后重组机制，以及去除MNPs后功能恢复与EPS结构恢复的关系，仍缺乏系统研究。为此，研究人员开展了该项研究，旨在阐明粒径和表面功能化共同调控下的分子毒性机制，并为评估MNPs在Anammox系统中的生态风险提供新视角。该论文发表于《Ecotoxicology and Environmental Safety》。

**关键技术与方法**

研究人员从长期稳定运行的实验室规模Anammox反应器获取厌氧颗粒污泥（AnGS），其进水含NH₄⁺-N和NO₂^--N各300 mg/L和360 mg/L。选用粒径2 μm的聚苯乙烯微塑料（PS-MP）和100 nm的原始、氨基化（PS-NH₂）及羧基化（PS-COOH）聚苯乙烯纳米塑料。在12小时急性暴露和12小时恢复试验中，通过扫描电子显微镜（SEM）观察污泥微观形态；测定比厌氧氨氧化活性（SAA）表征脱氮性能；利用商业试剂盒测定细胞内ROS水平；采用热提取法分步提取松散结合型EPS（LB-EPS）和紧密结合型EPS（TB-EPS），并用BCA法和蒽酮-硫酸法分别定量蛋白质和多糖；通过傅里叶变换红外光谱（FT-IR）对酰胺I带（1700–1600 cm^?1）进行去卷积分析蛋白质二级结构变化；采用三维激发发射矩阵（3D-EEM）荧光光谱分析EPS荧光组分。

**研究结果**

**3.1 氮去除性能的变化**
通过测定急性暴露和恢复期的比氨消耗速率（SAANH₄⁺-N）和比亚硝酸盐消耗速率（SAANO₂^--N），发现MNPs对AnGS脱氮性能的抑制强度顺序为：PS-NH₂ > PS-NP > PS-MP > PS-COOH。PS-NH₂在200 mg/L浓度下抑制率达82.8%（SAANH₄⁺-N）和84.8%（SAANO₂^--N），且恢复期后仍保留73.7%和75.4%的抑制，表明其引起短期功能抑制而非可逆损伤；PS-MP、PS-NP和PS-COOH引起的抑制基本可恢复。PS-COOH毒性最低，可能与静电排斥和羧基竞争螯合EPS内阳离子有关，表明表面电荷比粒径更重要。

**3.2 微观形态**
通过SEM观察200 mg/L处理组，PS-NH₂组在急性期后表面明显粗糙、孔隙增多，恢复期仍保留多孔结构，其他组则趋于对照状态，提示PS-NH₂造成更持久的物理扰动。

**3.3 细胞内ROS水平变化**
在200 mg/L浓度下，PS-NH₂引起ROS强度较对照增加32.1%，与脱氮抑制协同，提示通过静电吸引导致过量ROS积累是其主要毒性机制之一。

**3.4 EPS含量的变化**
所有MNPs处理均导致EPS蛋白质含量显著下降，顺序为PS-NH₂ > PS-COOH > PS-NP > PS-MP。PS-NH₂使TB-EPS蛋白质减少60%，归因于直接生物毒性；PS-COOH引起大量蛋白质流失但功能抑制较轻，提示流失可能与界面相互作用有关。恢复期PS-COOH组出现过度补偿，但脱氮性能未完全恢复；PS-NH₂组EPS蛋白恢复至对照的70–81%，但脱氮性能无显著恢复，显示EPS数量与功能恢复间存在失配。

**3.5 蛋白质二级结构的变化**
通过FT-IR酰胺I带去卷积分析发现，急性期PS-NH₂在TB-EPS中引起α-螺旋比例下降（从18.0%降至16.9%）和聚集链比例显著上升（至27.3%），反映了不可逆的蛋白质错误折叠和聚集，是PS-NH₂直接损伤膜相关功能蛋白的分子证据。传统α-螺旋/(β-折叠+无规卷曲)比值因未考虑聚集链增加而失真，在此背景下聚集链比例是更直接的病理指标。恢复期PS-NH₂组TB-EPS聚集链比例显著下降，提示细胞激活蛋白质质量控制（PQC）系统进行主动修复，但LB-EPS中聚集链仍维持高水平，表明PQC修复能力存在空间局限性；而传统比值在恢复期降至最低，反映存活细胞合成功能受损，新分泌蛋白质结构有序性差，解释了EPS数量恢复未能转化为功能恢复的原因。

**3.6 3D-EEM光谱分析**
PS-NH₂使EPS荧光峰从类色氨酸蛋白质物质（Peak B）偏移至类芳香族蛋白质物质（Peak A），并出现约20 nm蓝移，归因于色氨酸残基暴露后与疏水聚苯乙烯表面结合。PS-COOH组急性期荧光强度最高，提示非荧光组分优先流失；恢复期总蛋白质虽过度补偿，但荧光强度下降，表明优先合成非荧光结构蛋白以重建物理屏障，功能荧光蛋白恢复滞后。

**讨论与结论总结**

讨论部分指出，PS-MNPs对AnGS的毒性由粒径和表面化学协同决定：粒径效应确认MPs抑制低于NPs；表面电荷决定两种损伤模式——正电荷PS-NH₂通过致死性生理毒性（ROS激增和蛋白质聚集）引起最严重且持久的抑制，负电荷PS-COOH主要通过物理破坏EPS基质而表现出较低生物毒性。重要的是，EPS数量恢复与脱氮性能恢复存在显著失配，如PS-NH₂组EPS含量恢复至对照81.6%而Anammox活性仅达26.3%，表明EPS构象完整性而非数量是系统恢复力的决定因素。由于恢复期仅12小时，持续抑制应解释为短期功能抑制而非不可逆损伤，未来需延长恢复期并结合多组学分析。

本研究的结论：PS-MNPs对AnGS的毒性受粒径和表面化学的协同调控。首先，确认了明确的粒径依赖性毒性：MPs对脱氮性能的抑制效应（SAANH₄⁺ 26.4%，SAANO₂^- 31.2%）显著低于NPs（SAANH₄⁺ 38.0%，SAANO₂^- 41.9%）。其次，在MNPs中，表面电荷决定了两种不同的损伤机制：带正电的PS-NH₂通过以强烈氧化应激（ROS水平增加32.1%）和严重蛋白质聚集为特征的致死性生理毒性模式，引起最严重且持续的功能抑制（活性下降82.8%）；相比之下，带负电的PS-COOH表现出NPs中最低的生物毒性，主要通过损害EPS基质完整性而非细胞活性的物理破坏模式发挥作用。至关重要的是，EPS数量恢复与脱氮性能恢复之间存在显著失配。例如，在PS-NH₂组中，虽然EPS含量恢复到对照水平的81.6%，但Anammox活性仅达到26.3%。这种定量差异表明，EPS的构象完整性，而非其单纯的数量，是系统恢复力的决定因素。然而，由于本研究的恢复实验仅限12小时，观察到的持续抑制应被解释为短期功能抑制而非确定的不可逆损伤。未来研究应延长恢复期（例如7天或更长），并结合多组学分析以区分单细胞代谢修复与群落水平再生长。总体而言，这些发现强调未来的环境风险评估必须同时基于粒径和表面理化性质对塑料进行分类。此外，观察到的EPS数量与功能恢复之间的差异为准确评估受污染生态系统的真实健康和恢复力提供了一个新的分子基准。