《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Hydramethylnon-induced pulmonary toxicity associated with necroptosis signaling and mitochondrial dysfunction in human bronchial epithelial cells
编辑推荐：
杀虫剂已被广泛应用于各种家用产品中，而研究人员先前的研究显示，在测试的五类杀虫剂中，hydramethylnon（HM）在大鼠和人A549细胞中显示出显著的肺毒性。在本研究中，研究人员利用BEAS-2B和16HBE14o细胞调查了HM诱导的人支气管上皮细胞（H
杀虫剂已被广泛应用于各种家用产品中，而研究人员先前的研究显示，在测试的五类杀虫剂中，hydramethylnon（HM）在大鼠和人A549细胞中显示出显著的肺毒性。在本研究中，研究人员利用BEAS-2B和16HBE14o细胞调查了HM诱导的人支气管上皮细胞（HBECs）毒性背后的分子机制。此外，这些机制通过气管内滴注模型在小鼠中得到进一步证实。HM处理在两种细胞系中诱导了细胞毒性，特征为细胞周期阻滞、细胞增殖抑制以及具有凋亡特征的细胞死亡。值得注意的是，HM处理触发了坏死性凋亡信号（necroptosis signaling）的快速增加，证据是受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）和混合谱系激酶结构域样蛋白（MLKL）的磷酸化，以及随后在线粒体处的坏死性凋亡信号。这一激活破坏了线粒体稳态，证据是线粒体含量减少（通过线粒体外膜转位酶20（TOM20）荧光强度下降评估）、线粒体DNA丢失、电子传递链复合物蛋白减少、三磷酸腺苷（ATP）耗竭、活性氧（ROS）增加以及线粒体自噬的诱导。这种坏死性凋亡相关的线粒体功能障碍最终导致HBECs出现具有凋亡特征的细胞死亡。一致地，小鼠气管内滴注HM诱导了急性肺损伤，伴有显著的坏死性凋亡信号、气道支气管上皮细胞中线粒体丢失以及具有凋亡特征的细胞死亡增加。这些发现表明，HM在体外和体内诱导了与坏死性凋亡信号和线粒体功能障碍相关的支气管上皮细胞毒性，揭示了一种吸入毒性的新机制，并突出了含HM家用产品的潜在风险。
Hydramethylnon（HM）是一种氨基腙类杀虫剂，广泛用于家用害虫防治（如蚂蚁和蟑螂诱饵）。尽管标准啮齿动物研究中其吸入毒性被归类为低毒性（Category IV），但研究人员先前发现，配方成分如聚乙二醇（PEG）可显著增强HM的肺毒性，提示其真实暴露条件下的安全性可能被低估。支气管上皮细胞是吸入暴露的首要靶点，对维持肺稳态至关重要，其高代谢活动依赖线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）提供能量。然而，HM诱导吸入毒性的分子机制尚不明确，尤其是坏死性凋亡信号与线粒体功能障碍之间的因果关系。为此，研究人员Su Hwan Park等人利用人支气管上皮细胞系BEAS-2B和16HBE14o进行体外实验，并结合小鼠气管内滴注模型，系统探究了HM的毒性机制。结论表明，HM通过激活RIPK1/MLKL介导的坏死性凋亡信号，导致线粒体功能障碍（包括线粒体丢失、ATP耗竭、ROS升高），最终引发具有凋亡特征的细胞死亡和气道损伤。这一发现揭示了HM吸入毒性的新机制，强调了含HM家用产品的潜在风险。论文发表在《Ecotoxicology and Environmental Safety》。
关键技术方法（不超过250字）：
（1）体外细胞模型：采用BEAS-2B和16HBE14o人支气管上皮细胞系。
（2）细胞活力检测：WST-8法。
（3）细胞周期与凋亡分析：流式细胞术（Hoechst 33342染色、Annexin V-FITC染色）。
（4）蛋白表达分析：免疫印迹检测RIPK1/MLKL磷酸化、线粒体电子传递链复合物等。
（5）线粒体功能评估：免疫荧光（TOM20）、线粒体DNA定量（qPCR，以tRNALeu和B2M为引物）、ATP比色/荧光法、DCFDA ROS测定、线粒体分级（subcellular fractionation）检测p62转位。
（6）动物模型：8周龄雌性ICR小鼠（购自Hanabiotech Ltd.，韩国）经气管内滴注HM（100 μg/只），进行组织病理学、免疫组化（IHC）及TUNEL凋亡检测。
研究结果（保留小标题并说明通过什么研究得出什么结论）：
**3.1 Effects of HM on the proliferation and survival of HBECs**：通过WST-8检测发现HM浓度依赖性降低BEAS-2B和16HBE14o细胞活力；流式细胞术显示HM诱导G1期细胞周期阻滞，并增加Annexin V阳性细胞比例；免疫印迹显示增殖标志物cyclin D1和c-Myc下调，凋亡标志物cleaved PARP上调，LDH释放增加。结论：HM通过抑制增殖、诱导周期阻滞和凋亡特征引起细胞毒性。
**3.2 Effect of HM on glycolytic capacity in HBECs**：ATP检测显示HM显著降低细胞内ATP水平；免疫印迹未改变糖酵解酶表达及上游信号（ERK、AKT、p38、c-Jun、NF-κB）磷酸化；葡萄糖消耗未受影响，但乳酸分泌显著增加。结论：HM导致ATP减少和乳酸升高，提示线粒体功能受损。
**3.3 Effect of HM on mitochondrial homeostasis in HBECs**：免疫荧光显示HM降低TOM20荧光强度（线粒体减少）；qPCR显示mtDNA拷贝数下降；免疫印迹显示电子传递链复合物I–V蛋白表达下调；DCFDA检测显示ROS升高；线粒体分级检测到p62向线粒体转位（线粒体自噬诱导）。结论：HM破坏线粒体稳态，导致线粒体丢失和能量代谢崩溃。
**3.4 Effect of HM on necroptosis signaling in HBECs**：免疫印迹显示HM迅速增加RIPK1和MLKL磷酸化（p-RIPK1、p-MLKL）；线粒体分级检测到RIPK1在线粒体积累；化学诱导坏死性凋亡（necroptosis inducer）可重现HM的表型（线粒体减少、ETC降低、ATP下降、乳酸增加）。结论：HM激活坏死性凋亡信号，驱动线粒体功能障碍。
**3.5 Role of HM-induced necroptosis signaling in mediating its toxicity in HBECs**：时间过程显示坏死性凋亡信号在早期（0–60 min）激活，而cleaved PARP在后期（12–24 h）出现；坏死性凋亡抑制剂Nec-1可部分逆转HM诱导的线粒体丢失、cleaved PARP表达和LDH释放；联合使用Nec-1和凋亡抑制剂Z-VAD-FMK比单独处理更显著恢复细胞活力。结论：坏死性凋亡信号是上游事件，部分驱动凋亡特征和细胞毒性，两者协同作用。
**3.6 Verification of HM-induced necroptosis signaling and apoptotic features in a mouse model**：组织病理学显示HM滴注后24小时肺泡炎症细胞浸润、间质增厚，7天时炎症消退但出现轻度纤维化；IHC显示p-RIPK1升高、TOM20降低；TUNEL显示凋亡细胞增加。结论：体内结果与体外一致，证实坏死性凋亡信号和线粒体丢失与气道损伤相关。
讨论部分总结：本研究首次阐明HM通过坏死性凋亡信号介导的线粒体功能障碍导致气道上皮损伤的机制。与以往仅关注凋亡的研究不同，研究人员提出坏死性凋亡是上游驱动因素：HM不直接通过化学毒性杀死细胞，而是激活程序性坏死途径。坏死性凋亡信号（RIPK1/MLKL）的快速激活先于线粒体损伤，且化学诱导坏死性凋亡可重现HM表型，而抑制坏死性凋亡可逆转损伤，证实其因果作用。线粒体功能障碍表现为ETC复合物下调、ATP耗竭、ROS升高及线粒体自噬，导致能量代谢崩溃和细胞死亡。此外，坏死性凋亡与凋亡在时间上存在差异，联合抑制效果更佳，提示两者互作。这些发现为吸入毒性提供了新见解。
研究结论：在本研究中，研究人员证明了HM主要通过坏死性凋亡信号介导的线粒体功能障碍在体内外诱导气道上皮损伤。HM迅速激活RIPK1/MLKL信号，导致线粒体丢失、电子传递链复合物下调、ATP耗竭和ROS水平升高。这些线粒体缺陷随后导致具有凋亡特征的细胞死亡，并且联合抑制坏死性凋亡信号和凋亡相关信号可有效减轻HM诱导的细胞死亡。总之，这些发现确立了坏死性凋亡信号驱动的线粒体破坏是HM诱导气道上皮毒性的核心机制。
