γ辐照与环氧乙烷灭菌对晶态及无定形药物固体稳定性的影响

《European Journal of Pharmaceutical Sciences》：Impact of Gamma Irradiation and Ethylene Oxide Sterilisation on the Stability of Crystalline and Amorphous Drug Solids

　　

终末灭菌是拟用于胃肠外给药或侵入性给药的药物产品中的关键工艺，但传统灭菌方法可能损害热不稳定或化学敏感性药物物质。在本研究中，研究人员评估了5种药物物质的晶态与无定形固体形式——倍他米松二丙酸酯（betamethasone dipropionate, BMD）、雌二醇（estradiol, E2）、伊曲康唑（itraconazole, ITZ）、维莫德吉（vismodegib, VDG）和佐米曲普坦（zolmitriptan, ZMT）——与灭菌γ辐照及环氧乙烷（ethylene oxide, EtO）循环的相容性，评价指标为化学稳定性与物理稳定性。物理稳定性通过对灭菌前后晶体粉末和无定形固体进行目视检查评估，并采用差示扫描量热法（differential scanning calorimetry, DSC）表征晶态药物的熔融行为，以及无定形形式中的玻璃化转变与重结晶事件。化学稳定性则采用反相高效液相色谱法（reverse phase-high-performance liquid chromatography, RP-HPLC）、液相色谱-质谱联用法（liquid chromatography–mass spectrometry, LC-MS）和氢核磁共振波谱（¹H-NMR）进行考察。

γ辐照和EtO均保持了BMD、E2、ITZ和VDG的化学完整性。ITZ出现的可逆性颜色变化归因于自由基形成，这一点通过温和加热、HPLC和LC-MS得到证实。尽管E2保持了化学完整性，但灭菌后其结晶性和热行为发生了改变。ZMT对灭菌表现出显著敏感性：γ辐照诱导了物理软化和氧化降解，在无定形形式中尤为明显；EtO灭菌则诱导ZMT发生羟乙基化，LC-MS证实形成了多种烷基化衍生物。

总体而言，灭菌相容性主要受分子结构而非药物固态形式支配。这些发现为灭菌策略的选择提供了见解，并有助于推动晶态和无定形药物固体向临床应用转化。

该文发表于《European Journal of Pharmaceutical Sciences》，围绕终末灭菌对药物固体理化稳定性的影响展开系统研究。研究背景在于，注射或侵入性给药制剂必须满足严格无菌要求，终末灭菌因可在最终包装状态下完成灭菌、降低后续污染风险而被优先采用。然而，许多药物活性成分及其递送系统具有热敏性、湿敏性或化学反应敏感性，传统湿热或干热灭菌往往不适用。因此，γ辐照与环氧乙烷（ethylene oxide, EtO）等低温终末灭菌技术在医药和医疗器械领域得到广泛应用。尽管这两类技术在器械产品中的应用基础较为成熟，但针对药物原料本身，尤其是比较晶态与无定形两种固态形式对灭菌响应差异的系统研究仍较少。鉴于无定形药物在固体分散体、植入剂及微针等先进制剂中应用日益广泛，而其热力学稳定性通常低于晶态，因此明确不同药物分子在不同固态下对灭菌应力的响应规律，对于无菌药物产品与递送平台的理性设计具有现实意义。

基于此，研究人员选择5种化学结构差异明显、临床用途不同的模型药物，即倍他米松二丙酸酯（BMD）、雌二醇（E2）、伊曲康唑（ITZ）、维莫德吉（VDG）和佐米曲普坦（ZMT），分别制备其晶态和无定形固体，系统考察其在γ辐照和EtO终末灭菌后的无菌达标情况、外观变化、热行为、药物含量、杂质谱及分子结构变化。研究得出的核心结论是：两种灭菌方式均可达到药典规定的无菌保证水平（sterility assurance level, SAL）；多数药物的灭菌相容性主要由分子结构决定，而固态形式的影响相对次要；γ辐照总体上对BMD、ITZ、VDG较为相容，对E2虽不改变化学结构但会影响其无定形稳定性；EtO对BMD、ITZ、VDG总体可接受，但会引发ZMT显著的羟乙基化反应。该研究的重要意义在于，为晶态及无定形药物固体终末灭菌工艺的选择建立了分子结构导向的判断依据，并为其临床转化提供了实验支持。

研究人员采用的关键技术方法主要包括：首先通过熔融后冷却制备无定形药物，并以差示扫描量热法（DSC）确认其玻璃态特征；随后将样品分别接受25 kGy γ辐照或EtO灭菌循环处理，并依照《欧洲药典》进行无菌检查。物理稳定性通过外观观察和DSC分析评价；化学稳定性则结合反相高效液相色谱（RP-HPLC）进行含量与杂质分析，液相色谱-质谱联用（LC-MS）用于降解产物鉴定，氢核磁共振（¹H-NMR）用于结构层面的进一步确认。所有样品均三重复测定，并采用单因素方差分析评估差异显著性。

在研究结果方面，首先是“3.1. Sterility analysis”。研究人员按照药典流程对灭菌后的晶态及无定形样品进行14天培养观察，结果显示所有样品均未检出细菌或真菌污染，表明γ辐照和EtO均实现了有效灭菌。个别ZMT和BMD晶体样品曾出现短暂浑浊，但经转接新鲜培养基继续观察5天后未见微生物生长，因此被判断为颗粒理化性质导致的假象，而非灭菌失败。

其次是“3.2. Visual observations post-sterilisation”。目视观察显示，VDG、BMD和E2在两种灭菌后均无明显形貌或颜色变化。ITZ在γ辐照后出现特征性变色：无定形样品表现为灰绿色，晶体样品呈浅棕色，而EtO处理后无此现象。进一步对辐照后的无定形ITZ进行40°C、5分钟温和加热，原色恢复，由此说明该变化属于与自由基形成相关的可逆性着色，而非不可逆化学破坏。ZMT则在两种灭菌条件下均表现出更敏感的外观变化：EtO处理的晶体样品由白色转为金黄色；无定形样品在制备后即呈琥珀或金黄色，灭菌后颜色未进一步加深，但颗粒融合、形态塌陷，提示其物理状态受到了明显影响。

再次是“3.3. Drug solid-state form post-sterilisation”。DSC结果显示，晶态ITZ、VDG、BMD和E2在灭菌后均保留清晰熔融吸热峰，说明其晶体熔融行为总体未被明显破坏。无定形ITZ、VDG和BMD在灭菌前后也保持典型无定形热行为，包括玻璃化转变温度（glass transition temperature, T_g）、结晶放热峰和后续熔融峰，提示其热特征基本保留。值得注意的是，无定形ITZ经γ辐照后结晶峰温度显著升高，说明其冷结晶行为发生改变，研究人员据此指出γ辐照可能提高了该无定形体系的表观稳定性，但同时也强调由于缺乏储存时间对照，尚不能将这一变化完全归因于辐照本身。E2则表现出不同模式：其无定形样品在γ辐照和EtO后结晶焓明显降低，计算得到的结晶度参数升高，表明灭菌促进了其部分结晶化，损害了无定形稳定性，但并未引起明确化学降解。ZMT是固态变化最显著的药物：晶态ZMT经EtO后原有136°C熔融峰消失，提示固态形式丧失；经γ辐照后晶态熔融峰仍存在。无定形ZMT经γ辐照后T_g由49°C降至19°C，表明无定形相发生增塑和软化；EtO处理后则出现136°C熔融峰而缺少前置T_g和结晶事件，说明样品已重结晶并失去无定形成分。

接着是“3.4. Chemical stability assessment by RP-HPLC and LC-MS”。RP-HPLC表明，除ZMT外，所有药物在两种灭菌后含量均无显著下降。BMD和VDG的含量保持在标示值附近，LC-MS亦未见明显结构改变。ITZ经γ辐照后检测到少量相对分子质量为671.27的杂质，水平约为0.23%–0.29%，与既往报道的去卤相关辐解产物一致，但其比例极低，不足以构成显著化学不稳定。E2经两种灭菌处理后含量维持在98.89%–99.92%，LC-MS未检出新增峰，进一步证实其化学结构稳定。与此形成鲜明对比的是ZMT。其晶态样品经EtO后含量下降至约61%，色谱图出现多个新峰，提示产生多种降解产物。LC-MS进一步识别出m/z 332.2、376.2和420.2等信号，分别对应单羟乙基、双羟乙基和三羟乙基取代产物，另有m/z 303.2提示吲哚基团氧化，表明EtO可在标准灭菌条件下与ZMT发生显著烷基化和氧化反应。研究人员还专门验证了无定形ZMT制备过程中出现的颜色变化并非化学降解，因为其未经灭菌时RP-HPLC和LC-MS与晶态对照无显著差异。值得注意的是，无定形ZMT经EtO后的含量约为93%，明显高于晶态形式，且新增色谱峰较少，说明虽然其降解途径相同，但反应程度较轻。研究人员据此认为，这一差异更可能与无定形样品较低的暴露表面积有关，而非其化学本征稳定性提高。相较之下，γ辐照对ZMT的化学影响较弱，仅在无定形样品中观察到与吲哚氧化相关的低质量碎片离子，提示其主要引发氧化损伤，而不产生EtO那样广泛的加成修饰。

然后是“3.5. Nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR) analysis”。¹H-NMR进一步验证了上述化学稳定性结论。ITZ、BMD、VDG和E2在灭菌前后光谱基本一致，支持其未发生可检测的结构修饰。ZMT则在EtO处理后显示出显著谱图变化，尤其是晶态样品。在3.10–3.40 ppm和3.50–3.90 ppm等脂肪族区域出现新的共振信号，并伴有3.98 ppm和4.06 ppm宽单峰以及4.12–4.25 ppm重叠信号，这些变化与EtO开环后在ZMT一个或多个氮原子上发生N-烷基化所形成的NCH₂和CH₂OH氢信号相一致。芳香区出现7.22 ppm和7.36 ppm等额外信号，提示吲哚环也发生了修饰，可能与氧化或吲哚氮烷基化有关。无定形ZMT经EtO后的NMR变化方向与晶态一致，但强度明显更低，与其较轻的降解程度相符。

在讨论部分，研究人员综合指出，本研究最重要的认识是：终末灭菌相容性不能依据“晶态优于无定形”或“某种灭菌方法普遍适用”进行简单概括，而必须立足于具体分子的化学官能团特征。γ辐照在25 kGy条件下对多数药物较为温和，BMD和VDG几乎不受影响，ITZ虽出现明显变色，但该现象主要与可退火自由基色心有关，且仅伴随极低水平的辐解杂质；E2虽未发生结构破坏，但其无定形体系对两类灭菌均存在结晶化风险。EtO方面，BMD、ITZ和VDG总体相容，但ZMT因含有易受EtO烷基化攻击的含氮位点而表现出明显化学敏感性。研究还强调，固态形式并非完全无关：ZMT的无定形态在γ辐照后更易软化并发生氧化，提示较高分子流动性和自由能可能增加其灭菌应激脆弱性；但ITZ的无定形态并未因此发生永久化学破坏，说明无定形系统对灭菌的脆弱性并非普遍规律，而是取决于分子组成与反应位点。

研究结论部分可译为：本研究系统评估了5种药物分子的晶态和无定形形式与γ辐照及环氧乙烷灭菌之间的化学和物理相容性。尽管两种灭菌方法均达到所需无菌保证水平（SAL），其对理化稳定性的影响却随分子结构并在较小程度上随物理形态而显著不同。γ辐照维持了BMD、ITZ和VDG的化学与物理完整性，对ITZ仅产生轻微且可逆的化学效应。E2与两种灭菌技术在化学层面相容，但其无定形稳定性均受到削弱，并检测到结晶含量增加。ZMT在暴露于两种灭菌技术后同时表现出化学反应性和物理不稳定性。EtO暴露后，研究人员阐明了晶态与无定形ZMT均可发生羟乙基化；γ辐照则诱导ZMT熔融及氧化变化。这些结果强调，应针对具体药物分子评估其与特定灭菌程序的相容性。总体而言，研究结果表明，药物固态形式的终末灭菌无论采用γ辐照还是EtO，都必须依据药物化学官能团及其分别对辐射介导反应或烷基化介导反应的易感性来加以指导。