图像赋能细胞分选技术可实现具有不同功能潜能的原始造血干细胞的 prospectively 分离

《Experimental Hematology》：Image-enabled cell sorting permits prospective isolation of primitive hematopoietic stem cell subsets with distinct functional potential

　　

荧光激活细胞分选（Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS）一直是识别、表征和分离造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells, HSCs）的核心技术，允许对以特定强度表达特定分子的细胞进行前瞻性分离。一项近期的技术突破——图像赋能细胞分选（Image-Enabled Cell Sorting, ICS），基于FACS但还允许根据分子在细胞内的差异分布进行分离。研究人员利用ICS对原代HSCs进行研究，考察了一系列细胞内标记物的表达模式，并确定线粒体染料是前瞻性分离具有不同特性的HSCs的工具。将索引分选（index sort）数据与单细胞分裂动力学整合分析发现，MitoTracker染料的总强度（Total Intensity）和扩散性（diffusivity）是能够前瞻性分离功能异质性HSCs的参数。体内功能实验证实，具备长期多系贡献能力的HSCs在MitoTracker低扩散性、低强度群体中高度富集。此外，显示高MitoTracker强度但低MitoTracker扩散性（Mito±）的HSCs，表现出低MitoTracker强度（Mito-/-）HSCs的特征，代表了一个仅能通过ICS等工具分离的HSCs亚群。总之，这些数据表明，ICS是一种在造血系统中前瞻性富集高度特异性细胞群体的强大工具，在需要群体识别和纯度以实现稳健细胞和分子表征的应用中具有广泛用途。

论文解读：图像赋能细胞分选技术在造血干细胞功能异质性研究中的应用

研究背景与意义

造血干细胞（Hematopoietic Stem Cells, HSCs）的prospective分离长期依赖荧光激活细胞分选（Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS）。尽管FACS能根据总荧光强度分选细胞，却无法捕捉分子在细胞内的空间分布差异。HSCs存在显著的功能异质性，尤其在自我更新与分化潜能上，但传统分选方法限制了对其精细亚群的分离与解析。图像赋能细胞分选（Image-Enabled Cell Sorting, ICS）是在FACS基础上融合实时成像的新技术，可对单个细胞的标记物分布进行量化分析。本研究发表于《Experimental Hematology》，研究人员利用ICS技术，聚焦线粒体与溶酶体等细胞器的染色模式，旨在建立一种新的分选策略，以分离功能不同的HSC亚群，并评估其体外与体内功能。

主要关键技术方法

研究人员以野生型C57BL/6J及B6.SJL小鼠为供体，采用免疫磁珠富集骨髓造血干祖细胞（HSPCs），用MitoTracker Green FM（MTG-FM）或LysoTracker Green（LTG-DND26）进行细胞器染色，并通过表面抗体组合（EPCR⁺CD45⁺CD150⁺CD48^-，即ESLAM表型）定义HSCs。使用BD FACSDiscover S8仪器进行活细胞ICS分选，采集总强度（Total Intensity, TI）与扩散性（Diffusivity）等成像参数。功能性评估包括：单细胞10天克隆形成与分裂动力学检测、极限稀释移植（Limiting Dilution Assay, LDA）及二次移植实验，结合流式细胞术分析克隆表型组成与外周血嵌合率。

研究结果

Image-enabled cell sorting resolves mitochondrial and lysosomal heterogeneity in primary mouse HSCs

研究人员首先对ESLAM HSCs进行MTG-FM或LTG-DND26染色，通过ICS采集活细胞图像。以CD45成像确认单细胞活性与感兴趣区域（Region of Analysis, ROA）。结果显示，MTG-FM与LTG-DND26的总强度可区分高/低染色亚群，活细胞图像验证了分选门控与真实荧光分布的一致性，证明ICS可解析原代HSCs中线粒体与溶酶体的异质性。

Clonal in vitro assays combined with index-sort data analysis identify two key novel imaging parameters to classify HSCs

研究人员将单细胞分选后的10天克隆大小与索引分选的成像参数关联分析。在MTG-FM参数中，总强度与扩散性与克隆大小呈正相关：高总强度或高扩散性HSCs倾向于形成更大克隆。径向矩（Radial moment）与偏心率（Eccentricity）未显示明显关联。LTG-DND26的扩散性则未能有效分层HSCs。据此，研究人员选择总强度与扩散性作为前瞻性分选参数。

Lysosomal staining did not resolve for phenotypically distinct HSC fractions

进一步验证发现，基于LTG-DND26高/低强度分选的Lyso^+/+与Lyso^-/-HSCs，在体外分裂动力学、10天克隆大小及表型组成（Lin^-、LSK、ELSK比例）上均无显著差异。因此，溶酶体染色不适用于ICS介导的HSC功能分层，后续实验集中于线粒体染色。

Prospective isolation of HSC subsets inferred by the integration of total intensity and diffusivity of MTG-FM

研究人员将MTG-FM总强度与扩散性联合设门，将ESLAM HSCs分为四群：Mito^+/+（高强度高扩散）、Mito^-/-（低强度低扩散）、Mito^±（高强度低扩散）、Mito^-/+（低强度高扩散）。比较两端群发现，Mito^-/-退出静息态更慢，第二次分裂延迟，形成更小克隆，且克隆中成熟Lin⁺细胞更少，LSK比例更高。用钙泵抑制剂（维拉帕米、利血平）处理并未改变群体功能差异，表明MTG-FM分层不依赖于染料外排。

Image-enabled cell sorting permits exclusion of intermediate phenotypes

中间表型Mito^±与Mito^-/+的分裂动力学更接近Mito^-/-，但10天克隆产量更接近Mito^+/+；其成熟细胞产出比例与Mito^-/-相似。这表明中间群并不等同于两端极端的混合，MTG-FM染色呈连续分布。传统FACS无法区分这四群，会掩盖功能异质性，而ICS可有效纯化具有不同体外功能的HSCs。用TMRE（测线粒体膜电位Δψ_mt）重复实验，虽可分层分裂动力学，但对克隆大小与组成的分辨不及MTG-FM，提示膜电位并非驱动命运差异的主因。

ESLAM HSCs with low MTG staining are enriched for functional HSCs

体内极限稀释移植显示，移植5或20个HSCs时，Mito^-/-受者在16周时总体及髓系嵌合率更高，骨髓与脾脏供体来源HSPCs比例更高。二次移植后差异更显著：Mito^-/-组所有20-HSC剂量受者均成功重建，5-HSC剂量也有37.5%重建；而Mito^+/+组5-HSC剂量无重建。极端极限稀释分析（ELDA）估计，Mito^-/-中具长期再植能力的HSCs频率约为Mito^+/+的6倍（二次移植中达6倍），证明低MTG-FM总强度与低扩散性可富集长期重建HSCs。

讨论与结论总结

讨论部分指出，HSCs功能异质性的成因多样，但前瞻性分离手段的不足限制了机制解析。本研究利用ICS建立了基于MTG-FM成像参数（总强度与扩散性）的HSC分选新策略，可将ESLAM HSCs分层为多个功能不同的亚群（各占约10–20%）。传统观点认为静息HSCs进入细胞周期时代谢转向氧化磷酸化（OXPHOS）并伴随高线粒体活性，但新近研究支持增殖HSCs也可依赖糖酵解及磷酸戊糖途径（PPP）。本研究发现，Mito^+/+（高总强度、高扩散性，暗示较高Δψ_mt）在体外增殖更快、分化更多；而Mito^-/-在体内长期重建及二次移植中更优，与既往低Δψ_mt富集长期重建HSCs（LT-HSCs）及人HSC标志（CD201/EPCR、CD34、CD90）高表达相符。溶酶体探针LTG-DND26未能有效分层HSCs，可能因其与多种酸性细胞器结合，未来可尝试专用报告小鼠。MTG-FM主要不定量线粒体含量，未来可用mito-Dendra2等报告小鼠进一步关联线粒体分布、不对称分配、局部能量与钙调控对HSC命运的影响。ICS成像分辨率虽低于共聚焦显微镜，但可高通量耦合功能分析，为长期重建HSCs的鉴定、体外扩增及临床应用提供了新思路。

研究结论翻译

研究人员利用活细胞图像赋能细胞分选（ICS），基于线粒体染料MTG-FM的成像参数——总强度与扩散性，建立了一种新型分选策略，可将原代小鼠ESLAM HSCs分层为功能各异的亚群。低MTG-FM总强度与低扩散性（Mito^-/-）的HSCs在体外退出静息较慢、形成较小且较未成熟的克隆，但在体内长期多系重建及串行移植中显著优于高强度的Mito^+/+细胞。中间表型并不简单等同两端混合，传统FACS会混淆这些功能差异。ICS通过解析细胞内标记物空间分布，可前瞻性纯化异质性HSC子集，为造血系统的高纯度细胞与分子表征提供广泛应用可能。