利用整合计算机模拟、体外和细胞内方法揭示鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）骨胶原中的新型抗氧化肽及其潜在多维机制

《Food Chemistry: X》：Unveiling novel antioxidant peptides from silver carp (Hypophthalmichthys molitrix) bone collagen and underlying multi-dimensional mechanism by integrating in silico, in vitro, and in cellulo approaches

　　

该研究首次通过整合计算机模拟（in silico）、体外（in vitro）和细胞内（in cellulo）方法，揭示了来源于鲢鱼骨胶原（silver carp bone collagen, SCBC）的新型抗氧化肽及其潜在多维机制。研究人员从SCBC中鉴定出AEDVN、EDDR和DVEL，它们具有良好的DPPH^·清除活性（半数抑制浓度（IC₅₀）= 0.89–2.59 mM）、强Fe²⁺螯合能力（IC₅₀ = 0.98–3.72 mM），以及对模拟胃肠消化（simulated gastrointestinal digestion, SGID）的高稳定性。酰氨基、胍基和N端氨基可分别作为它们的主要氧化还原活性位点。它们能与Keap1内Kelch结构域的核心残基（如ARG380、ARG415和ARG483）形成强氢键和静电吸引，从而激活Keap1-Nrf2-ARE抗氧化通路。因此，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）、过氧化氢酶（catalase, CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase, GSH-Px）的活性显著提高，导致丙二醛（malondialdehyde, MDA）减少，并改善H₂O₂诱导氧化损伤下的细胞活力。这些发现为鱼副产物骨头作为天然抗氧化源的高值化利用提供了一种经济高效且省时省力的策略。

论文解读文章

**研究背景、问题与意义**
抗氧化剂在保护人体免受氧化应激相关慢性疾病（如糖尿病、炎症、高血压、神经退行性疾病和动脉粥样硬化）中发挥关键作用。现有合成抗氧化剂（如没食子酸丙酯、丁基羟基茴香醚和叔丁基对苯二酚）常伴有长期使用不利的副作用。因此，源于天然的低分子量抗氧化肽因具备多靶点调控能力、无毒性、低不良感官影响等优势，成为更安全的替代品。鲢鱼（Hypophthalmichthys molitrix）是亚太区域重要的淡水养殖鱼类，中国年产量超386万吨，其鱼骨占鲜重约13%，富含胶原蛋白等营养物质，但大部分被废弃，造成环境污染和经济损失。尽管胶原蛋白因其独特序列组成和强疏水性被认为是抗氧化肽的良好来源，且已有从其他鱼骨（如鲣鱼、罗非鱼、鲟鱼）中鉴定出胶原衍生抗氧化肽的研究，但鲜少涉及鲢鱼骨胶原（silver carp bone collagen, SCBC）。同时，传统基于体内方法开发生物活性肽耗时、昂贵且对动物不友好。因此，该研究旨在整合计算机模拟（in silico）、体外（in vitro）和细胞内（in cellulo）方法，首次揭示SCBC中的新型抗氧化肽及其多维作用机制，为鱼副产物高值化利用提供经济高效的策略。该论文发表在《Food Chemistry: X》。

**关键技术与方法**
研究人员使用了以下主要关键技术方法：（1）从UniProt数据库获取SCBC的α1(I)-链和α2(I)-链序列，使用SignalP 5.0预测去除信号肽，并通过BIOPEP-UWM数据库进行单一及组合蛋白酶（27种代表性蛋白酶）的虚拟水解，计算抗氧化片段频率（A_{antioxidative}）和理论水解度（DH）。（2）利用AnOxPePred V1.0在线工具（深度学习算法）预测肽的游离自由基清除潜力（FRS）和过渡金属离子螯合潜力（CHEL）。（3）通过Discovery Studio V2019软件进行分子对接，以人Keap1蛋白晶体结构（PDB ID: 2FUL）为受体，计算结合亲和力（–CDOCKER相互作用能，–CIE）并分析非键相互作用模式。（4）采用GaussView V5.0和Gaussian 16W进行密度泛函理论（density functional theory, DFT）量子化学计算，分析前沿分子轨道和全局反应描述符。（5）利用SwissTargetPrediction和Genecards数据库进行潜在抗氧化靶点预测，通过STRING数据库构建蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络，并使用DAVID数据库进行基因本体（Gene Ontology, GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析。（6）体外化学评估：DPPH^·清除实验和Fe²⁺螯合实验，计算半数抑制浓度（IC₅₀）。（7）细胞内验证：采用H₂O₂诱导氧化损伤的HepG2细胞模型（来源：北京生物化学与细胞生物学研究所），测定细胞活力（MTT法）、SOD、CAT、GSH-Px活性和MDA含量。（8）模拟胃肠消化稳定性实验：包括模拟唾液消化（SSD）、模拟胃消化（SGD）和模拟肠消化（SID）。

**研究结果**
**3.1 SCBC的模拟蛋白酶解**
通过比较27种单一蛋白酶的A_{antioxidative}和理论DH，发现蛋白酶K、无花果蛋白酶和胰凝乳蛋白酶A的效果最优。组合酶解结果表明，“胰凝乳蛋白酶A + 无花果蛋白酶”组合使α1(I)-链和α2(I)-链的平均A_{antioxidative}最高（0.0036，DH为51.00%），被认为是制备SCBC抗氧化肽的最佳酶解方法。

**3.2 肽释放与虚拟筛选**
在上述组合酶解条件下，从α1(I)-链和α2(I)-链中分别释放125和114个肽，其中60个为共有肽，大部分为二肽和三肽（MW200–400 Da）。通过去除已知抗氧化肽、潜在过敏原肽和毒性肽后，剩余119个肽进行虚拟筛选。基于与Keap1结合亲和力（—CIE）、FRS和CHEL的加权总分（50%间接活性+50%直接活性），筛选出总分>90的7个候选肽（P1、P10、P37、P53、P54、P94、P98）。

**3.3 合成及体外抗氧化活性评估**
7个候选肽经Fmoc固相合成，纯度>95%。体外DPPH^·清除和Fe²⁺螯合实验显示，P1（AEDVN）、P10（EDDR）和P98（DVEL）表现出最佳活性：DPPH^·清除IC₅₀分别为0.89、2.59和1.40 mM；Fe²⁺螯合IC₅₀分别为0.98、1.39和3.72 mM，均优于或接近谷胱甘肽（GSH，DPPH IC₅₀=0.11 mM，Fe²⁺ IC₅₀=7.65 mM）。其他候选肽活性较弱或无效。

**3.4 细胞内毒性与抗氧化活性验证**
在HepG2细胞模型中，P1、P10、P98在200–1000 μM浓度下均无细胞毒性。对H₂O₂诱导的氧化损伤，这些肽使细胞存活率从41.40%显著提升至60.39–84.01%（p<0.05），同时显著提高SOD、CAT、GSH-Px活性（p<0.05），降低MDA含量（p<0.05），间接表明它们能够激活Keap1-Nrf2-ARE通路产生抗氧化酶，减轻氧化损伤。整体细胞保护效果排序为P1 > P10 ≈ P98。

**3.5 鉴定肽对SGID的稳定性**
经模拟唾液、胃和肠消化后，P1、P10、P98的DPPH^·清除和Fe²⁺螯合能力仅下降2.41–7.52%，整体活性保留率为82.99–94.29%，表明它们对胃肠环境具有高抵抗力，有利于作为功能性食品成分应用。

**3.6 鉴定肽的理化与药代动力学性质**
P1、P10、P98的序列长度为4–5个残基，MW 450–550 Da，疏水性>10 kcal/mol，等电点（pI）2.9–3.7，在中性溶剂中带2个负电荷，呈鲜味（归因于高含量的天冬氨酸D和谷氨酸E残基），水溶性良好（21.38–109.65 mM）。药代动力学吸收、分布、代谢、排泄（ADME）特性显示：人肠吸收（HIA）概率>0.80，人口服生物利用度（HOB）较低（13–17%），血浆蛋白结合率（PPB）较高（29–49%），提示可能需要靶向递送策略；它们不是P-糖蛋白（P-gp）的底物（概率≤0.25）而是抑制剂（概率>0.50），有利于细胞内滞留；不是细胞色素P450（CYP450）的底物或抑制剂（概率≤0.25），代谢安全性高。

**3.7 鉴定肽的前沿分子轨道分析**
DFT量子化学计算显示，P1、P10、P98的HOMO-LUMO能隙（ΔE）最小（5.13–5.61 eV），表明反应活性最高。活性位点分布分析：P1的主要活性位点为N5残基酰氨基的N38-H40，P10为R4残基胍基的N32-H71，P98为N端D残基氨基的N8-H9。这些位点可通过提供单电子或形成稳定p-π共轭结构来淬灭自由基。全局描述符中，P10具有最低的化学势（μ）、最低的化学硬度（η）和最高的化学柔软度（S），其次为P1和P98，与它们的强抗氧化活性一致。

**3.8 鉴定肽与Keap1的潜在互作机制**
分子对接显示，P1、P10、P98与Keap1的结合亲和力（—CIE）为103.19–107.71 kcal/mol，远高于参考配体TX6（29.67 kcal/mol）。它们主要通过10–12个常规氢键、2–4个碳氢键和3–6个静电吸引/盐桥与Keap1的Kelch结构域核心残基（如ARG380、ARG415、ARG483、TYR572、SER508）结合，而TX6主要依靠疏水作用（π-π、π-烷基、烷基）结合。这表明鉴定肽通过强非键作用竞争性阻断Keap1-Nrf2相互作用，从而激活Keap1-Nrf2-ARE通路。

**3.9 鉴定肽的潜在抗氧化靶点与PPI网络**
网络药理学预测显示，P1、P10、P98共有49个重叠靶蛋白（与抗氧化的1330个相关靶点取交集），其中19个为三者共有。PPI网络包含48个节点和226条边。基于8种拓扑算法（MCC、MNC、EPC、Degree、Closeness、Betweenness、Radiality、Stress）筛选出6个枢纽靶点：PTGS2、SIRT1、MMP2、CASP3、PPARG和MMP9。其中MMP9、CASP3和PPARG与其他抗氧化靶点连接最多。MMP9上调可加速细胞外基质降解和炎症；PPARG激活可促进Nrf2转录并抑制NF-κB通路下调MMP9；CASP3通过线粒体途径诱导凋亡，但可被Keap1-Nrf2-ARE通路通过上调血红素加氧酶-1抑制，保护细胞免于轻中度氧化损伤诱导的凋亡。

**3.10 基于GO和KEGG分析的抗氧化保护通路**
GO分析显示，潜在靶点在生物学过程（BP）中主要富集于蛋白水解（40.82%）、凋亡过程正调控（26.53%）和凋亡过程（22.45%）；细胞组分（CC）主要分布于胞质溶胶（61.22%）、细胞质（57.14%）和质膜（46.94%）；分子功能（MF）主要涉及蛋白结合（87.76%）和金属离子结合（38.78%），与鉴定肽的高Keap1结合亲和力和Fe²⁺螯合能力一致。KEGG富集分析显示，靶点主要富集于癌症（28.57%）、脂质与动脉粥样硬化（24.49%）和凋亡（20.41%）等通路，包括NF-κB、肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素-17（IL-17）信号通路。五个枢纽靶点（除SIRT1外）参与这些通路，提示鉴定肽可能通过多通路调控氧化还原。

**总结与讨论**
该研究通过整合计算机模拟、体外和细胞内方法，首次从鲢鱼骨胶原（SCBC）中揭示并鉴定了三种新型抗氧化肽AEDVN、EDDR和DVEL。它们具有优良的直接（自由基清除、金属螯合）和间接（激活Keap1-Nrf2-ARE通路）抗氧化活性，对模拟胃肠消化高度稳定，在HepG2细胞中无毒并可保护细胞免受氧化损伤。量子化学和分子对接阐明了其作用位点与机制：酰氨基/胍基/N端氨基作为活性位点，肽与Keap1的Kelch结构域核心残基形成强氢键和静电吸引，激活Keap1-Nrf2-ARE通路，上调SOD、CAT、GSH-Px活性，降低MDA含量，提高细胞活力。网络药理学进一步提示了除Keap1-Nrf2-ARE通路外，可能通过NF-κB、TNF、IL-17等信号通路调控MMP9、CASP3、PPARG等多个靶点发挥抗氧化作用。研究结论翻译如下：该工作首次通过整合计算机模拟、体外和细胞内方法，揭示了SCBC来源的新型抗氧化肽及其潜在多维机制。结果表明，“胰凝乳蛋白酶A + 无花果蛋白酶”可通过模拟蛋白酶解成为最优组合酶解策略，从SCBC中释放179个肽，其中7个肽经虚拟筛选成为抗氧化候选肽。通过体外评估和细胞内验证，最终鉴定出AEDVN、EDDR和DVEL为新型抗氧化肽。它们显示出良好的DPPH^·清除活性（IC₅₀分别为0.89、2.59和1.40 mM）、强Fe²⁺螯合能力（IC₅₀分别为0.98、1.39和3.72 mM）、对模拟胃肠消化的高稳定性（活性保留82.99–94.29%），以及在HepG2细胞中的无细胞毒性（200–1000 μM）。量子化学分析表明，酰氨基、胍基和N端氨基分别是它们的关键氧化还原活性位点。分子对接结果表明，它们可通过强氢键和静电吸引与Keap1内Kelch结构域的核心残基（如ARG380、ARG415和ARG483）结合，从而激活Keap1-Nrf2-ARE抗氧化通路。因此，抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px的活性显著提高，导致MDA产生减少，进而改善H₂O₂诱导氧化损伤后的细胞活力。此外，网络药理学分析提示了它们除Keap1-Nrf2-ARE通路外，在体内可能通过调控多个靶点（如MMP9、CASP3和PPARG）参与其他抗氧化通路（如NF-κB、TNF和IL-17信号通路）。该工作为淡水鱼副产物的高值化利用提供了理论支持，并有助于理解胶原肽的多维抗氧化机制。