《Food Microbiology》：Establishment of a degenerate primer-based multiplex qPCR method for sensitive detection of Gas-Producing Bacillus spp. in soy sauce
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当前热加工食品的质量控制措施主要依赖于产品发生腐败后的被动分析，而非针对特定腐败微生物的主动监测。本研究从胀袋酱油中分离获得64株产气菌株，并鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefac
当前热加工食品的质量控制措施主要依赖于产品发生腐败后的被动分析，而非针对特定腐败微生物的主动监测。本研究从胀袋酱油中分离获得64株产气菌株，并鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）、贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）和地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。其中，贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）首次被证实与酱油产气腐败相关。研究人员直接在酱油中开展接种实验，证实不同菌种可在1–3 d内发生种属特异性的产气现象。在所检测菌种中，地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）因产气起始时间最早（1 d）而构成最高风险。为追踪污染来源，研究人员分析了酱油加工过程中的关键控制点。高通量测序（High-throughput sequencing，HTS）结果显示，在高温条件下芽孢杆菌属（Bacillus spp.）丰度升高，其中JY100组中以贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis，38.11%）、枯草芽孢杆菌（B. subtilis，6.13%）和解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens，4.83%）为主，而地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）主要检出于设备管道。为实现主动监测，研究人员开发了一种多重定量聚合酶链式反应（quantitative real-time polymerase chain reaction，qPCR）检测方法。其中，基于gyrB的简并引物组可同时检测枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）和贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis），而地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）则采用基于adk的特异性引物组进行检测。该方法对15株非目标菌株均未出现交叉反应。各菌种在纯培养物和酱油样品中的检测限（limit of detection，LOD）分别为101、105、108和102 CFU/mL，扩增效率介于92.71%至100.92%之间。将该方法应用于84份市售样品时，阳性检出率为15.48%。该综合策略推动了从腐败后被动分析向前瞻性主动监测的转变，并为热加工食品中微生物腐败风险管理提供了可复制的技术框架。
本文发表于《Food Microbiology》，围绕热加工酱油中产气性腐败菌的识别、污染路径解析与快速监测方法建立展开。研究背景在于，酱油作为重要发酵调味品，在工业化生产中常面临胀袋问题，而产气微生物是导致包装膨胀、产品劣变、经济损失及品牌风险的重要因素。既有质量控制多依赖于产品出现腐败后的追溯性分析，缺乏对特定腐败菌的前瞻性、定向化监测手段。与此同时，芽孢杆菌属（Bacillus spp.）因具有较强耐热性、可形成芽孢并长期滞留于生产环境，在热加工食品中尤其容易成为残留和再污染来源。以往研究已在胀袋酱油中检出枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），也有研究在其他热加工食品中发现产气的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），但针对酱油中多种产气芽孢杆菌共存、污染来源复杂、传统检测通量不足等问题，仍缺少系统解决方案。因此，开展该研究的必要性在于建立从分离鉴定、生态溯源到分子检测一体化的主动防控框架，以填补“发现腐败菌”与“实时监测预警”之间的技术空缺。
研究人员首先从胀袋袋装酱油中分离菌株，并结合产气验证与种属鉴定明确主要腐败菌群组成。结果显示，在随机选取的75株分离株中，61株经杜伦管法证实具有产气能力；文摘部分进一步概括为分离获得64株产气菌株，主要包括解淀粉芽孢杆菌、贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。其中，贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）首次在胀袋酱油中被确认与产气腐败相关，拓展了酱油腐败相关菌谱。进一步地，研究人员将代表性菌株直接接种至商业酱油中，验证其在真实基质中的产气行为，证实上述4种芽孢杆菌均可在1–3 d内引发产气，且地衣芽孢杆菌产气起始时间最早，提示其在实际生产中具有更高风险等级。
在污染溯源层面，研究将酱油生产过程中的关键控制点纳入分析，尝试识别不同菌种的潜在富集或残留环节。高通量测序（HTS）结果表明，在高热条件相关样品中芽孢杆菌属相对丰度较高，尤其在JY100组中，贝莱斯芽孢杆菌占38.11%，枯草芽孢杆菌占6.13%，解淀粉芽孢杆菌占4.83%；而地衣芽孢杆菌主要出现在设备管道中。这一结果说明，不同产气芽孢杆菌在生产系统中的分布并不一致，前者更可能与高热处理后仍能存留或相关环节富集有关，后者则提示设备卫生死角和管道系统可能是重要再污染来源。该部分结果为工艺优化和关键控制点设置提供了依据，也使后续定向检测具有明确对象和场景。
在检测技术方面，研究的核心创新是建立了基于简并引物（degenerate primer）的多重实时荧光定量聚合酶链式反应（multiplex qPCR）方法。传统培养法不仅检测周期长，而且难以覆盖多菌种共存情形，也无法有效识别处于活的但不可培养状态（viable but non-culturable，VBNC）的细胞。常规qPCR虽具有快速和灵敏优势，但此前多局限于单重或低重（≤3重）检测，难以满足酱油中4种及以上产气菌并存的场景需求。针对这一问题，研究人员设计了基于gyrB基因的简并引物组，用于同步检测枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌；同时设计基于adk基因的特异性引物组，用于检测地衣芽孢杆菌。该策略兼顾了广谱覆盖与种属分辨率，突破了低重检测方法在复杂食品体系中的应用限制。
主要技术方法概括如下：研究首先从中国某酱油生产企业不同批次胀袋袋装酱油中分离菌株，并采用杜伦管法进行产气表型验证；随后结合菌种鉴定明确目标菌群。为评估真实腐败能力，研究人员在商业酱油中实施人工接种实验。污染溯源部分采用高通量测序（HTS）分析生产过程关键控制点微生物群落组成。分子检测部分围绕gyrB和adk靶基因设计引物并建立多重qPCR体系，通过特异性、扩增效率、检测限（LOD）及市售样品应用进行方法学验证；最终将该方法应用于84份商业样品评价实际检出效果。
以下结合论文主体结果进行解读。
一、Isolation of strains from swollen bagged soy sauce
该部分通过对胀袋酱油样品进行分离培养和产气验证，明确了引发包装膨胀的核心菌群。研究从不同胀袋样品中随机选取75株分离株，其中61株经杜伦管法证实产气。种属构成显示，解淀粉芽孢杆菌为优势菌，其次为贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌。该结果说明，酱油胀袋并非由单一菌种导致，而是多种芽孢杆菌共同参与的腐败现象；同时也表明，贝莱斯芽孢杆菌应被纳入酱油产气腐败监测范围。
二、Analysis of the gas production potential of Bacillus species in soy sauce
该部分通过在商业酱油中进行接种实验，验证各目标菌在实际食品基质中的致腐败能力。研究结果表明，4种芽孢杆菌均能够在1–3 d内引发产气，但不同菌种产气起始时间存在差异。地衣芽孢杆菌最早在1 d即表现出产气，风险最高。此结果并非仅停留于分离与鉴定层面，而是通过真实酱油体系中的功能验证，建立了“检出菌种—产气表型—腐败风险”之间的直接联系，为风险分级管理提供了实验依据。
三、关键控制点与污染路径分析
该部分通过生产过程样品分析和高通量测序，解析不同产气芽孢杆菌在生产链中的分布特征。研究显示，在高热相关条件下，芽孢杆菌属丰度升高，其中JY100组中贝莱斯芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌占比较高；而地衣芽孢杆菌主要定位于设备管道。由此可见，一部分菌群可能与耐热芽孢在热处理后残留有关，另一部分则更可能与设备再污染途径相关。该发现支持在不同控制节点采取差异化干预策略，例如针对高热后环节关注耐热芽孢存活风险，针对管道系统强化清洗消毒和卫生监测。
四、多重qPCR方法建立
该部分是全文的方法学核心。研究基于目标菌种间保守与变异区域的比较，构建了简并gyrB引物组和特异性adk引物组，实现对4类关键产气芽孢杆菌的同步检测。gyrB方案用于同时覆盖枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和贝莱斯芽孢杆菌，adk方案则专一识别地衣芽孢杆菌。该设计体现了简并引物在多靶标食品微生物检测中的应用价值，即在单一反应框架内扩大检测覆盖面，并减少分别检测多物种所需的资源消耗。
五、方法特异性、灵敏度与实际样品验证
研究通过15株非目标菌株验证了所建方法的特异性，结果未见交叉反应，表明方法具备良好选择性。检测限（LOD）和扩增效率评估显示，该方法在纯培养物和酱油基质中均具有较高灵敏度和稳定性，扩增效率介于92.71%–100.92%。当应用于84份市售样品时，阳性检出率达到15.48%，说明该方法不仅适用于实验室条件下的技术验证，也能够在实际市场样品筛查中发挥作用，具备产业化监测潜力。
从讨论部分来看，论文强调当前关于酱油产气菌的研究仍以事后问题处理为主，缺乏集成式预防框架。本研究的重要推进在于：第一，首次从胀袋酱油中分离并确认贝莱斯芽孢杆菌与产气腐败相关，完善了酱油产气腐败菌谱；第二，通过酱油接种实验和关键控制点分析，建立了菌种风险差异及其污染路径认知，其中地衣芽孢杆菌因更早产气而被界定为高风险菌；第三，构建了基于简并引物的多重qPCR检测体系，将传统“发现问题后再分析”的模式转变为可用于生产过程前瞻性监测的技术路径。研究意义不仅在于酱油行业的质量安全控制，也在于为其他热加工食品中耐热、产气、复合型腐败菌的监测提供了可迁移的技术范式。
论文结论部分可译述如下：
总之，本研究构建了一套用于酱油生产中产气细菌前瞻性控制的综合性、系统性方法学体系。其核心产出是一套实用工具包，包含3个组成部分：关键控制点识别、菌株特异性污染机制表征以及稳健的多重qPCR检测方法。该工具包使行业能够从被动的问题处置转向主动的风险预防。更广泛的意义在于，该模型为热加工食品中微生物腐败风险管理提供了可推广的参考框架。
