在帕金森病中，特罗克瑟鲁汀通过调节小胶质细胞的NOX4/Nrf2轴来减轻与铁死亡相关的神经炎症

《Free Radical Biology and Medicine》：Troxerutin mitigates ferroptosis-related neuroinflammation by regulating the microglial NOX4/Nrf2 axis in Parkinson’s disease

　　

王启成|徐新怡|刘子祺|王若迅|兰欣瑞|李静|王赛楠|孙志远|史丽瑜|高玉彤|潘佳华|李伟|钱丽

江苏省高等学校核酸与细胞命运调控重点实验室（扬州大学），医学院，江苏省扬州市，225001，中国

摘要

帕金森病（PD）的特点是多巴胺能神经元的进行性退化及慢性神经炎症。越来越多的证据表明，小胶质细胞的铁死亡（ferroptosis）在PD的发病机制中起着关键作用。槲皮素（Troxerutin，TRX）是一种具有强抗氧化和抗炎活性的天然黄酮类化合物，已显示出神经保护潜力；然而，其对小胶质细胞铁死亡的影响及其在PD中的潜在机制仍不清楚。在本研究中，我们探讨了TRX在1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶（MPTP）诱导的PD小鼠模型以及MPP⁺刺激的BV2细胞中的效果。TRX能够改善运动表现，保护黑质-纹状体多巴胺能神经元，并减轻体内小胶质细胞的激活和促炎细胞因子的表达。在BV2细胞中，TRX减少了与铁死亡相关的变化，降低了脂质活性氧的积累，并恢复了GPX4和SLC7A11的表达。此外，使用经典的铁死亡诱导剂erastin处理会重新激活与铁死亡相关的反应，并逆转TRX的抗炎效果，这表明铁死亡应激与小胶质细胞的炎症激活有关。通过细胞热位移测定法证实了TRX与NOX4之间的目标结合。TRX增强了NOX4的K48连接多聚泛素化，并促进了其蛋白酶体降解，从而恢复了Nrf2在细胞核中的积累并激活了下游的抗氧化反应。这些结果表明，TRX通过调节PD中的小胶质细胞NOX4/Nrf2轴来缓解与铁死亡相关的神经炎症。

引言

帕金森病（PD）是最常见的进行性神经退行性疾病之一，其特征是多巴胺能（DA）神经元的退化及病理性的α-突触核蛋白聚集[1]，[2]。最近的研究表明，由大脑中的常驻先天免疫细胞——小胶质细胞介导的慢性神经炎症在PD的发病机制中起着关键作用[3]，[4]，[5]，[6]。当小胶质细胞被激活时，会释放多种神经毒性因子，包括促炎细胞因子和活性氧（ROS），这些因子会加剧DA神经元的死亡并推动疾病进展[4]，[7]。因此，调节小胶质细胞的激活是治疗PD的一个有前景的策略。

铁死亡是一种受调控的细胞死亡形式，其特征是铁的显著积累和脂质过氧化，越来越多地被认为是PD发病机制的关键驱动因素[8]，[9]，[10]。许多研究记录了PD患者大脑中铁的过度积累和脂质过氧化[11]，[12]，[13]。由于小胶质细胞具有很强的铁隔离能力，它们特别容易受到铁稳态失衡的影响[14]，[15]。因此，小胶质细胞可能作为连接氧化还原失衡、铁死亡应激和PD中神经炎症放大的核心细胞介质。然而，小胶质细胞铁死亡与PD中的神经炎症之间的机制关系仍不明确。

过量的ROS产生是触发脂质过氧化的关键上游事件[16]，[17]。在产生ROS的酶中，NADPH氧化酶4（NOX4）与中枢神经系统（CNS）的病理变化特别相关，因为它持续产生ROS。NOX4还与线粒体功能障碍、脂质过氧化和神经炎症损伤有关[18]，[19]。NOX4的病理性过度激活会产生过多的ROS，这些ROS会损害多不饱和脂肪酸（PUFAs）并引发脂质过氧化。此外，NOX4的过度激活会通过破坏Nrf2依赖的氧化还原调节来损害内源性抗氧化防御[18]，[20]。这种破坏会损害关键的抗铁死亡调节因子，包括谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和溶质载体家族7成员11（SLC7A11）[16]，[20]。尽管NOX4在铁死亡和氧化还原稳态中起着重要作用，但NOX4/Nrf2轴如何调节PD中的小胶质细胞铁死亡驱动的炎症的具体机制仍不清楚。

尽管临床使用了左旋多巴等药物，但目前的治疗方法只能暂时缓解症状，无法阻止DA神经元的进行性退化[21]。因此，寻找来自天然产物的更安全、更有效的疾病修饰剂至关重要。槲皮素（TRX）是从Sophora japonica L.中提取的天然生物黄酮类化合物的三羟乙基化衍生物，由于其较高的水溶性和良好的药代动力学特性而引起了学术界的广泛关注[22]，[23]。大量研究表明，TRX具有多种生物活性，包括强效的自由基清除、抗炎和抗凋亡作用[23]，[24]，[25]，[26]。这些特性突显了TRX在多种神经系统疾病中的神经保护作用。先前的研究表明，TRX可能减轻6-羟基多巴胺（6-OHDA）诱导的PD大鼠模型中的DA神经元退化[27]。然而，TRX是否通过调节小胶质细胞铁死亡相关的神经炎症来缓解PD相关病理尚不清楚。特别是，NOX4/Nrf2轴是否参与了TRX的抗铁死亡和抗炎作用尚未确定。

在本研究中，我们评估了TRX在MPTP诱导的PD小鼠模型和MPP⁺刺激的BV2小胶质细胞中的神经保护作用。我们进一步确定NOX4是TRX的潜在分子靶点，并证明TRX促进了NOX4的K48连接多聚泛素化和蛋白酶体降解，从而恢复了Nrf2依赖的抗氧化防御。这些发现为小胶质细胞铁死亡、神经炎症放大以及TRX介导的神经保护作用提供了机制框架。

章节片段

化学物质和试剂

本研究中使用的试剂和检测试剂盒如下：槲皮素（Sigma-Aldrich，#SML3724），芦丁（MACKLIN，#R817259），MPTP（Sigma-Aldrich，#M0896），MPP⁺（Sigma-Aldrich，#D048），Erastin（MedChemExpress，#HY-15763），DMSO（MedChemExpress，#HY-Y0320），胎牛血清（Gibco，#A5256701），DMEM/F12（Gibco，#11320082），高糖DMEM（Gibco，#11965092），青霉素-链霉素（100×）（MedChemExpress，#HY-K1006），胰蛋白酶（Gibco，#15050065），HighGene Plus转染试剂

TRX改善了MPTP诱导的PD小鼠模型中的运动缺陷和多巴胺能神经元退化

TRX的化学结构如图1A所示。为了确定TRX在MPTP诱导的PD条件下是否会产生全身暴露和可测量的脑内分布，我们在单次腹腔注射120 mg/kg TRX后进行了药代动力学和脑内分布分析。TRX迅速出现在血浆中，T_max为0.25小时，C_max为64,500 ng/mL。血浆AUC_{0-24 h}为52,823.7 ng·h/mL。重要的是，在腹腔注射后，TRX在脑组织中也能被检测到

讨论

在我们的研究中，我们证明了TRX通过抑制小胶质细胞相关的铁死亡和神经炎症，在实验性PD中表现出显著的神经保护作用。TRX改善了MPTP处理小鼠的运动障碍和DA神经元的损失，并减轻了MPP⁺刺激的BV2细胞中的炎症激活。从机制上讲，TRX靶向NOX4，促进其K48连接的多聚泛素化和蛋白酶体降解，恢复了Nrf2依赖的防御反应。这些发现表明TRX

结论

本研究表明，TRX通过抑制小胶质细胞的铁死亡和随后的神经炎症，减轻了PD中的运动缺陷和多巴胺能神经元的损失。从机制上讲，TRX靶向NOX4，促进其K48连接的多聚泛素化和蛋白酶体降解，加速了NOX4的降解，恢复了Nrf2的抗氧化反应，上调了GPX4和SLC7A11的表达，抑制了脂质过氧化，并抑制了神经毒性促炎细胞因子的释放。这些生物学过程

CRediT作者贡献声明

刘子祺：撰写 – 审稿与编辑，数据分析。钱丽：撰写 – 审稿与编辑，项目监督，资金获取。徐新怡：数据可视化，方法学设计，概念构思。李伟：撰写 – 审稿与编辑。王赛楠：撰写 – 审稿与编辑，验证。李静：撰写 – 审稿与编辑，验证。兰欣瑞：实验研究。王若迅：数据分析。潘佳华：撰写 – 审稿与编辑。高玉彤：实验研究。

伦理批准

所有研究计划均获得了扬州大学机构动物护理和使用委员会的批准（协议编号202403246），所有程序均符合当地的动物护理指南，并遵守ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南。

数据可用性

所有支持研究结果的原始数据可向相应作者索取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

资助

本工作得到了江苏省大学生创新创业培训计划（资助编号202411117253Y）和扬州大学的本科生科技创新基金（资助编号XCX20240831）的支持。

利益冲突声明

作者在本文讨论的任何材料中均没有财务或专利利益。

致谢

图形摘要是用BioGDP.com（[46]）创建的，我们感谢他们的支持。