综述：线粒体疾病：机制、信号传导与治疗机遇

《Free Radical Biology and Medicine》：Mitochondrial disease: mechanisms, signalling, and therapeutic opportunities

　　

线粒体是细胞代谢和信号传导的中心枢纽，其功能障碍是多种人类疾病的基础，包括罕见的线粒体疾病以及常见的神经退行性和代谢性疾病。线粒体疾病是由核DNA或线粒体DNA突变引起的遗传异质性疾病，这些突变损害氧化磷酸化（OXPHOS），导致ATP生成减少和细胞能量衰竭。尽管存在共同的生物能量缺陷，但这些疾病表现出显著的临床变异性，而这一异质性背后的机制仍知之甚少。目前尚无治愈性疗法，尽管几种代谢和实验性方法在临床前模型中显示出前景。线粒体功能障碍通常与氧化还原稳态改变和活性氧（ROS）生成增加有关，ROS可损害线粒体成分（包括线粒体DNA），并进一步损害呼吸链功能。同时，ROS也作为情境依赖性信号分子发挥作用，其效应随浓度、定位和细胞类型而变化，这使其在疾病机制和治疗开发中的解释复杂化。在本综述中，研究人员总结了线粒体疾病病理生理学的当前概念，重点关注限制机制理解和临床转化的未解决问题。研究人员批判性地评估了ROS在疾病进展和信号传导中的作用，讨论了替代氧化酶（AOX）如何成为剖析ROS相关机制并揭示线粒体功能障碍和疾病变异性的意外方面的有价值的实验工具。

以下是论文主体部分的学术专业性总结，保留原文小标题，每段内容符合小标题，专业术语以英文缩写标注，无引用和图示标识。

**Introduction**
线粒体是细胞质细胞器，在能量代谢及多种代谢和执行途径中发挥核心作用。线粒体由外膜（OMM）和内膜（IMM）组成，内膜形成嵴，嵴内含有呼吸链（RC）复合物（I-IV）和线粒体ATP合酶（复合物V, CV），通过氧化磷酸化（OXPHOS）将营养物中的能量转化为ATP。两个电子传递成分——辅酶Q（泛醌）（Q）和细胞色素c（cyt c）——将还原当量从复合物I（CI-NADH脱氢酶）和复合物II（CII-琥珀酸脱氢酶）转移至复合物III（CIII-泛醇-细胞色素c氧化还原酶），并进一步从CIII转移至复合物IV（CIV-细胞色素c氧化酶, COX）。在电子流动的同时，三个RC复合物将质子跨IMM泵入膜间隙，产生电化学梯度，由CV（ATP合酶）利用以合成ATP。此外，一些生物（如植物、寄生虫和低等真核生物）具有额外的非质子动力呼吸链成分，如替代氧化酶（AOX）及内部和外部定位的NADH脱氢酶。线粒体基质中含有多种中间代谢途径，包括丙酮酸脱氢酶复合物（PDc）和脂肪酸β-氧化酶，它们为三羧酸（TCA）循环和RC提供底物。哺乳动物线粒体拥有自身DNA——线粒体DNA（mtDNA），为16.5 kb的环状双链DNA，编码13个OXPHOS核心亚基、两个核糖体RNA（rRNA）和22个转移RNA（tRNA），这些tRNA参与线粒体编码蛋白的翻译装置。其余线粒体蛋白组由核基因组编码，在胞质中翻译后主动输入线粒体，支持mtDNA复制与维持、OXPHOS组装、线粒体动力学（如分裂与融合）及多种代谢过程。mtDNA为母系遗传，在体细胞中呈多拷贝状态，正常情况下为同质性。mtDNA的异质性（即野生型与突变型mtDNA共存）是mtDNA相关疾病的常见特征。mtDNA具有高度多态性，突变率约为核DNA的7-10倍。突变mtDNA需超过阈值水平才能导致细胞表型。异质性水平可在世代间剧烈变化，这由胚胎发育早期出现的瓶颈现象解释。有丝分裂过程中mtDNA随机分配到子细胞，导致不同组织中的突变负荷差异，即有丝分裂分离，这解释了mtDNA疾病中观察到的极端表型变异性。mtDNA因靠近呼吸链而易受氧化损伤，主要是由正常电子传递系统电子泄漏产生的活性氧（ROS）所致。虽然mtDNA被线粒体转录因子A（TFAM）包裹，但缺乏组蛋白，因此特别易受氧化损伤。线粒体是高度动态的细胞器，可根据代谢需求和组织类型通过分裂和融合事件重组结构。线粒体动力学受MFN1/2、OPA1（融合）和DRP1及其受体（如FIS1、MFF、MiD49/51）（分裂）介导的融合与分裂平衡控制，并受磷酸化、泛素化和氧化还原修饰等关键调控。细胞应激（如ATP耗竭、钙超载和氧化应激）常促进DRP1依赖性分裂，使受损线粒体片段被分离，随后通过PINK1-Parkin途径或受体介导机制（涉及BNIP3、NIX、FUNDC1）激活线粒体自噬（mitophagy）以清除功能障碍的线粒体，该过程与线粒体膜电位（Δψm）丧失紧密相关。Δψm的维持依赖于电子传递链完整性和质子泵活性，其耗散作为关键质量控制信号，稳定PINK1于线粒体外膜，触发泛素依赖性清除。这些过程的整合还受AMPK和mTOR等营养和能量感应途径调节，以协调线粒体生物合成、更新和代谢适应。

**Reactive oxygen species**
**Mitochondrial sources of ROS**
细胞氧还原活动的直接后果是产生ROS。ROS是极活泼的物种，通常由电子还原双氧生成超氧阴离子（O₂^•?）和羟基（•OH）自由基以及较不活泼的非自由基过氧化氢（H₂O₂）。NADPH氧化酶、黄嘌呤氧化酶、细胞色素p450等酶也产生ROS。羟基自由基通常由H₂O₂通过非酶途径（如Fenton化学）产生，被认为是细胞大分子最有害的活性物种。线粒体是细胞内ROS的主要来源，占所有ROS物种的约90%，主要产生于氧化磷酸化过程中的正向电子传递（FET）和反向电子传递（RET）。FET中，少量电子泄漏形成O₂^•?，主要发生在复合物I的FMN位点和复合物III的Q循环。RET则更为有害，电子从高度还原的醌池经复合物I回流，触发条件包括高膜电位、高度还原的泛醌池和内源性琥珀酸盐积累，典型情况发生于缺血/再灌注。再灌注时，氧水平迅速恢复使Δψm重建，促进Ca²⁺通过线粒体钙单向转运体（MCU）摄取，同时琥珀酸盐氧化导致ROS大量产生。同时，Na⁺/H⁺交换体驱动的pH正常化解除对线粒体通透性转换孔（mPTP）的抑制，最终诱导mPTP开放导致细胞死亡。

**ROS detoxification**
适度ROS作为重要信号分子，调控细胞增殖、分化和免疫应答。过度积累则导致氧化应激，损伤脂质、蛋白质和核酸，并激活细胞死亡程序。细胞已进化出有效系统将ROS转化为低活性化合物。超氧阴离子由超氧化物歧化酶（SOD）迅速转化为H₂O₂，有三种主要异构体：SOD1（胞质和线粒体膜间隙）、SOD2（线粒体基质）和SOD3（胞外）。过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（PRXs）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPXs）进一步将H₂O₂还原为H₂O。GPx是ROS清除硒蛋白，通过氧化谷胱甘肽（GSH）为二硫化谷胱甘肽（GSSG）将脂质氢过氧化物转化为相应醇，GSSG再由NADPH通过谷胱甘肽还原酶还原再生GSH。哺乳动物中有五种GPx（GPx1-4和GPx-6），具有不同细胞定位和底物特异性。

**ROS signalling**
ROS具有重要信号作用，多种转录因子响应氧化应激，包括核因子κB（NF-κB）、激活蛋白1（AP-1）、核因子红细胞2相关因子2（NFE2L2，亦称NRF2）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）。NF-κB和AP-1结合抗氧化酶如SOD2、CAT和GPx启动子调控区，在氧化应激下活性增强。在骨骼肌中，ROS调节PPARGC1A基因表达和NRF2活性。正常条件下，NRF2与KEAP1结合被隔离于胞质并被泛素-蛋白酶体系统降解；氧化应激时KEAP1特定半胱氨酸氧化，NRF2稳定并转位至核，结合抗氧化反应元件（ARE）诱导HO-1、NQO1、PRDX1、GST等保护因子表达。ROS参与毒物兴奋效应：生理水平为信号分子，过量则造成损伤。在成体干细胞中，ROS信号对命运决定重要。研究人员发现，在Cox15缺陷小鼠模型中，增加ROS信号通过诱导线粒体生物合成和卫星细胞增殖缓解肌病。ROS还通过调节激酶和磷酸酶影响信号网络。线粒体H₂O₂作为时空调节的非转录信号分子，在低瞬时浓度时作为可逆第二信使氧化调控蛋白中低pKa的半胱氨酸巯基，被硫氧还蛋白、谷胱甘肽系统迅速还原。胰岛素信号是浓度和时间依赖性氧化还原调控的范例。持续高H₂O₂负荷激活ASK1等激酶，导致JNK和p38 MAPK激活，磷酸化IRS-1抑制性丝氨酸，促进胰岛素抵抗。氧化还原调节还影响PTEN、MAPK磷酸酶、离子通道和钙处理。线粒体ROS常在靠近线粒体-内质网接触位点生成，局部H₂O₂浓度可显著高于胞质水平，实现选择性信号传导。另有机制涉及琥珀酸盐积累和胞外释放，作为信号代谢物结合琥珀酸盐受体1（SUCNR1/GPR91），激活免疫炎症通路。

**Other stresses**
线粒体功能还受内质网（ER）应激和亚硝化应激影响。ER应激通过PERK、IRE1和ATF6信号发挥作用，与线粒体在MAM处物理和功能耦合，慢性ER应激可扰乱线粒体钙稳态、脂质交换和代谢通量，损害OXPHOS并促进线粒体碎片化。亚硝化应激主要由过量一氧化氮（NO）和过氧亚硝酸盐（ONOO^?）引起，通过可逆和不可逆修饰呼吸链成分（如抑制CIV和S-亚硝基化关键代谢酶）加剧线粒体功能障碍，增强电子泄漏和ROS生成。ER应激和亚硝化应激与氧化应激协同，形成自我强化的细胞器功能障碍网络，加重生物能量衰竭和炎症凋亡信号。

**Mitochondrial diseases**
**1. General aspects**
“线粒体疾病”通常指由OXPHOS损害引起的遗传决定的临床综合征，导致多种症状，主要影响高能量需求器官（如脑、心和骨骼肌），但任何器官均可受累。原发性线粒体疾病（PMDs）由线粒体或核基因组的致病突变引起。mtDNA突变包括同质或异质性点突变和大片段重排。异质性点突变导致多种综合征，如MELAS、MERRF、NARP和Leigh综合征（LS）。同质性mtDNA突变主要导致Leber遗传性视神经病变（LHON）。mtDNA重排导致散发性进行性外眼肌麻痹（PEO）、Kearns-Sayre综合征（KSS）和Pearson综合征。

**2. Pathogenetic mechanisms of mitochondrial diseases**
不同突变与临床表型的联系常不明确，但已描述多种机制，包括：OXPHOS缺陷、ROS过量产生、线粒体动力学紊乱、蛋白输入减少、质量控制系统减弱、钙稳态改变、应激反应缺陷（如线粒体未折叠蛋白反应（UPR_mt）和整合应激反应）。线粒体动力学对维持功能网络、分布线粒体至高需能区域和混合mtDNA至关重要。线粒体自噬选择性清除损伤线粒体，缺陷时积累受损细胞器放大ROS并促进凋亡信号。细胞通过UPR_mt和整合应激反应（ISR_mt）等适应性途径尝试恢复稳态，但持续或过度应激转向细胞死亡。线粒体在钙稳态中起核心作用，功能障碍可导致钙超载、mPTP开放、膜电位丧失和凋亡激活。线粒体还是固有免疫的关键调节者，PMDs中OXPHOS缺陷触发mtDNA、心磷脂和ROS等释放，作为损伤相关分子模式（mtDAMPs）激活TLR9、NLRP3和cGAS-STING通路，驱动慢性促炎细胞因子和干扰素产生，加剧组织损伤。持续免疫信号加剧线粒体功能障碍，形成恶性循环。靶向NLRP3或cGAS-STING抑制在临床前模型中显示前景。

**3. Classification of mitochondrial diseases**
线粒体疾病可根据临床症状、遗传起源或生化缺陷分类。

**3.a. Mutations in genes encoding MRC subunits and assembly factors**
复合物I（CI）是呼吸链第一个最大酶复合物，CI缺乏是最常见的OXPHOS疾病，导致不同严重程度和发病年龄的综合征。CI缺乏临床表现包括Leigh病、进行性白质营养不良和严重新生儿乳酸中毒等。复合物II（SDH）结构亚基突变最常见导致遗传性肿瘤，SDHA突变也与Leigh综合征等线粒体表型相关。复合物III（CIII）缺乏较少诊断，临床异质性强，基因包括mtDNA编码的细胞色素b及核编码成分，BCS1L是最常见原因。复合物IV（CIV）缺陷具有高度遗传和临床异质性，超过30个基因相关，SURF1突变最常见。复合物V（CV）缺乏最常见由mtDNA基因MT-ATP6和MT-ATP8突变引起，核基因突变包括TMEM70等。

**3.b. Syndromes associated with mtDNA instability**
主要包括多种mtDNA缺失累积或定量mtDNA耗竭的孟德尔遗传疾病。相关基因包括线粒体复制体核心组分（POLG、TWNK、DNA2、MGME1）及维持dNTP池的酶（TP、TK2、DGUOK、RRM2B、SUCLA2、SUCLG1等）。融合调节因子OPA1和MFN2以及线粒体蛋白水解质量控制组分（SPG7、AFG3L2）也与多个缺失相关。临床表现包括成人发病的CPEO、MNGIE、Alpers-Huttenlocher综合征（AHS）、SANDO和SCAE。POLG突变是主要原因，超过300种突变引起广泛重叠疾病谱。TWNK、MGME1、DNA2、RNASEH1、SLC25A4、TFAM等基因突变也导致不同表型。涉及线粒体核苷酸代谢的基因如DGUOK、TK2、RRM2B、SUCLA2、MPV17、TYMP等突变导致组织特异性MDS。SSBP1突变导致mtDNA耗竭/缺失，引起视神经萎缩等。

**3.c. mtDNA translation defects**
涉及线粒体蛋白质合成（22个tRNA和2个rRNA）的母系遗传突变导致MELAS、MERRF和氨基糖苷类诱导性耳聋等。核基因编码的线粒体翻译因子突变导致严重早发综合征，如MRPS16、EFG1、EFTu、EFTs突变，以及PUS1突变引起MLASA。线粒体氨酰tRNA合成酶（mt-ARSs）突变导致一组罕见常染色体隐性遗传病，具有显著临床异质性和组织特异性。

**3.d. Mutations in genes controlling the synthesis of specific mitochondrial lipids and cofactors**
辅酶Q₁₀生物合成基因（COQ2、PDSS1、PDSS2）突变导致严重婴儿综合征伴原发性辅酶Q₁₀缺乏。血红素a合成酶（COX10、COX15）突变导致Leigh综合征或心肌病。硫化物解毒途径中的ETHE1突变导致乙基丙二酸脑病（EE），SUOX突变导致亚硫酸盐氧化酶缺乏。细胞色素c突变与血小板减少相关，HCCS突变导致男性致死和女性小眼畸形伴线性皮肤病变。

**4. Therapeutic strategies**
治疗方法分为广泛适用的策略和针对特定疾病的干预。广泛策略包括：代谢调控、增加线粒体生物合成、增强自噬/线粒体自噬、抑制线粒体介导的凋亡、有害代谢物解毒、电子传递链缺陷的代谢旁路以及核或线粒体转移技术。疾病特异策略包括：去除或中和特定毒性化合物、靶向核苷酸补充以及基因和细胞替代疗法。

**4.a. Metabolic manipulation**
代谢操控通过重塑底物可用性、氧化还原平衡和补偿性能量通路发挥作用。生酮饮食和酮体补充提供替代乙酰辅酶A燃料底物。精氨酸和瓜氨酸补充用于MELAS支持一氧化氮产生。三庚酸进行回补治疗。二氯乙酸（DCA）激活PDH，苯基丁酸调节线粒体应激反应。

**4.b. Increasing mitochondrial biogenesis**
增强线粒体生物合成通过PGC-1α及其上游调节因子AMPK和SIRT1发挥作用。AICAR刺激AMPK，尼克酰胺核糖（NR）激活Sirt1，在Sco2和Deletor小鼠模型中改善表型。PARP1抑制也能增加Sirt1活性。

**4.c. Increasing autophagy/mitophagy**
靶向mTORC1抑制（雷帕霉素）延长寿命和改善神经功能。但也有安全性问题。miR-181a/b可促进线粒体自噬和生物合成，在眼小畸形和LHON模型中保护视网膜神经元。

**4.d. Mitochondrial transfer**
线粒体细胞间转移可通过隧穿纳米管、细胞外囊泡或细胞融合进行。外源线粒体移植在细胞模型中恢复呼吸功能，在Dguok和Ndufs4敲除小鼠中改善线粒体功能和疾病表型。线粒体增强疗法（MAT）在Pearson和Kearns-Sayre患者中初步尝试显示可行性和安全性。

**4.e. Antioxidants**
抗氧化剂是主要治疗支柱。KH176在Ndufs4^?/?小鼠中改善运动协调但未延长寿命。N-乙酰半胱氨酸（NAC）和维生素E在gas-1线虫模型中挽救表型。普罗布考在斑马鱼中挽救CI和CV抑制但对CIV无效。NAC和抗坏血酸在COX4-1突变成纤维细胞中抑制ROS。

**4.f. Bypass of RC defects**
使用电子穿梭体绕过CI、III和IV缺陷。Ndi1（酵母中替代CI）和AOX（绕过CIII和IV）是例子。细菌毒素绿脓菌素也可绕过CIII缺陷。

**AOX**
AOX是非质子动力泛醇氧化还原酶，在植物、真菌和某些原生生物中作为替代电子传递链的末端氧化酶，从泛醌池分支绕过CIII和IV。其非质子动力性质使生物能量效率降至0-50%每碳。主要功能是维持线粒体稳态，在RC受损时维持TCA循环周转。AOX在氧化应激时上调。激活机制涉及TCA循环中间体（如丙酮酸、2-酮戊二酸）和AMP/IMP。植物AOX由二硫键调节，可被TRX系统还原。AOX属于二铁羧酸盐蛋白家族，为锚定于线粒体内膜外侧的单体型二聚体蛋白，已获得锥虫AOX晶体结构。来自海鞘Ciona intestinalis的AOX已用作治疗工具，在人类细胞和动物模型中可绕过CIII和CIV阻断，降低病理ROS。在GRACILE综合征小鼠模型中延长寿命并防止心肌病和神经炎症，但在CIV缺陷肌病小鼠中反而加重病情，归因于对ROS信号过度抑制。在早老突变小鼠中延迟贫血进展，但在神经干细胞和脑病理中无显著作用，并在骨骼肌中增强线粒体应激。这些发现表明AOX是强大工具，其表达、时机和组织靶向需谨慎平衡。

**Conclusions**
过去二十年，线粒体生物学认识显著进步，线粒体被视为整合代谢、信号和炎症通路的多功能细胞器，在细胞生理中发挥中心作用。技术进步，特别是下一代测序（NGS），提高了致病变异识别和诊断流程，但约40%患者仍缺乏分子诊断。第二个挑战是理解许多线粒体蛋白的分子功能，如SURF1和MPV17等功能未知。第三个挑战是治疗转化，临床前成功很少转化为有效临床治疗。AOX的使用展示了干预的复杂性和情境依赖性。结论是：尽管概念和技术取得实质性进展，线粒体疾病仍然复杂、异质且与细胞生物学其他方面深度交织。未来需要将系统水平理解与机制精确性结合，弥合诊断与治疗，将临床前发现转化为有意义的临床结果。