Th17介导的抗肿瘤免疫在患者来源类器官和自体免疫细胞共培养中预测头颈部癌症免疫治疗反应

《Immuno-Oncology and Technology》：Th17-mediated antitumor immunity in patient-derived organoid and autologous immune cell cocultures predicts response to immunotherapy in head and neck cancer

　　

背景：免疫检查点抑制剂（ICI）疗法可改善头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）患者的生存，但仅部分患者受益，凸显了早期识别响应者及功能性评估肿瘤-免疫相互作用的必要性。研究人员开发了一种自体共培养平台，将患者来源类器官（PDOs）与外周血单个核细胞（PBMCs）结合，以评估免疫反应并将临床前结果与临床结局相关联。材料与方法：从HNSCC标本扩增PDOs，并与PBMCs共培养，随后使用靶向程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）、淋巴细胞活化基因3（LAG-3）或其组合的ICI进行治疗。结果：PBMCs中富集了CD4⁺和CD8⁺ T细胞（约90%）以及CD16⁺CD56⁺自然杀伤细胞，且存在基线耗竭状态（LAG-3⁺、CTLA-4⁺）。T细胞介导的肿瘤杀伤发生在44%的病例中，并伴随Th1/Th17细胞因子特征。ICI治疗适度改变了T细胞表型，减少了耗竭（PD-1）并富集了细胞溶解亚群（CD4⁺IFN-γ⁺、CD8⁺TOX⁺）。白细胞介素（IL）-17A成为相关细胞因子，与FasL分泌相关，提示Fas/FasL轴的激活。在初治HNSCC患者中，高循环IL-17A水平与改善的生存相关，而其他细胞因子无预后价值。在一项非干预性观察性试验中，IL-17A的增加与良好的ICI反应呈正相关，表明其作为生物标志物的潜力。PDO活力以患者特异性方式对ICI反应下降，与细胞因子特征和临床结局一致。结论：总体而言，这一自体PDO-PBMC共培养平台结合纵向细胞因子分析，捕获了患者特异性肿瘤-免疫相互作用及患者间异质性，为HNSCC的实时反应预测、生物标志物发现和个性化免疫治疗提供了框架。

### 论文解读文章

#### 研究背景与目的

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是全球常见的恶性肿瘤，尽管多模式治疗不断进步，但晚期患者预后仍较差。免疫检查点抑制剂（ICI）治疗，如靶向程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）的抗体，已被批准用于可切除和复发/转移性HNSCC，但客观缓解率仅为15%-20%。目前，程序性死亡-配体1（PD-L1）联合阳性评分是唯一获批的预测性生物标志物，但无法准确识别所有可能受益的患者。因此，迫切需要能够真实再现肿瘤-免疫相互作用的转化模型，以指导患者个体化治疗策略。患者来源类器官（PDOs）作为一种离体平台，已被用于化疗和放疗反应的评估，但传统方法通常破坏肿瘤微环境，限制了ICI疗效的研究。为了解决这一问题，研究人员构建了一种自体共培养平台，将无基质PDOs与自体外周血单个核细胞（PBMCs）相结合，旨在功能性评估HNSCC中的肿瘤-免疫相互作用，预测ICI反应，并发现新型生物标志物。该研究发表在《Immuno-Oncology and Technology》上。

#### 主要关键技术方法

研究人员从新鲜的或生物库保存的HNSCC肿瘤标本中，采用无基质培养方法建立PDOs，保留了肿瘤的结构特征。共培养分两个阶段：首先，用抗CD3/CD28抗体预刺激PBMCs，并与经IFN-γ预处理的PDOs在含IL-2的培养基中共培养7天；然后，在效应阶段加入ICI（nivolumab、pembrolizumab、relatlimab或其联合）处理3天。通过Calcein AM荧光测定PDO活力，使用光谱流式细胞术分析免疫表型，并利用多因子检测分析上清液中的细胞因子/趋化因子。此外，纳入了76例初治HNSCC患者和5例接受贴息性ICI治疗患者的血浆样本（来自BIOTRUST-ONC研究）。样本队列来源于罗斯托克大学医学中心，包括35例患者的38个肿瘤标本（部分来自同步淋巴结转移）。

#### 研究结果

**1. 从新鲜和生物库保存的HNSCC建立无基质PDOs**
通过改良的无基质培养方法，成功从新鲜（75.0%）和生物库保存（71.4%）的样本中建立了PDOs。HE染色显示PDOs保留了原发肿瘤的组织结构特征（R2=1.000），且免疫荧光证实了HNSCC标志物EpCAM和pan-cytokeratin的表达及中等增殖活性（Ki-67）。这表明PDOs能够复现肿瘤异质性，适用于临床前治疗筛选。

**2. 自体PDO共培养比同种异体条件促进更强的T细胞扩增**
在自体共培养中，预刺激的自体T细胞扩增率显著高于同种异体T细胞（平均2.3 vs 1.3，P<0.05）。44.4%的病例观察到PDO活力下降，提示T细胞介导的细胞毒性，且PDO活力下降程度与T细胞扩增率正相关（Spearman r=0.69）。流式细胞术显示自体共培养中CD4⁺ T辅助细胞比例较高，而CD8⁺ T和自然杀伤（NK）细胞比例较低，且存在一定程度的耗竭标志物（PD-1、LAG-3、CTLA-4）表达。细胞因子谱分析显示，促炎细胞因子TNF-α、细胞毒性介质FasL、perforin、IFN-γ以及Th17相关细胞因子IL-17A显著升高，且FasL与IL-17A水平呈正相关（Spearman r=0.65）。

**3. 个体PDOs对PD-1和LAG-3阻断的敏感性**
在12例患者的共培养体系中，ICI处理（nivolumab、pembrolizumab、relatlimab及其联合）导致PDO活力呈高度异质性反应。应用≥20%活力变化作为二分法阈值，45.5%的样本对nivolumab敏感，36.4%对pembrolizumab敏感，27.3%对relatlimab敏感。联合治疗未能克服耐药。在匹配的原发灶-转移灶病例中，两者均对所有ICI耐药，提示固有耐药亚群的扩增。与临床结局（14例接受petarative 抗PD-1治疗的患者）相比，离体共培养体系再现了临床差异化反应模式。

**4. LAG-3阻断触发激活的、抗原特异性T细胞特征，同时维持耗竭表型**
ICI处理对T细胞亚群的影响因药物而异。Relatlimab单独或联合治疗增加了CD4⁺CD8⁺ T细胞和NK T细胞比例。PD-1阻断仅适度降低PD-1⁺和TOX⁺细胞，而relatlimab组中LAG-3⁺和CTLA-4⁺细胞显著上调。值得注意的是，relatlimab显著增加了CD8⁺ T细胞活化（CD3⁺CD8⁺CD25⁺），而nivolumab主要激活CD4⁺CD127⁺效应细胞。CD137（抗原特异性活化标志物）在pembrolizumab和relatlimab组中显著升高，表明LAG-3抑制驱动了更强的细胞毒性T细胞激活。

**5. 细胞因子特征定义患者特异性T细胞活化模式，并强调IL-17A作为潜在关键介质**
ICI处理后，细胞因子分泌模式呈现患者特异性。PD-1阻断适度增加TNF-α、FasL、perforin和IFN-γ，但个体间差异较大。LAG-3阻断显著增强了FasL分泌（P=0.06）以及IL-17A水平（P<0.05 vs 共培养对照）。IL-17A水平与PDO活力呈负相关（nivolumab组P<0.05，relatlimab组P<0.01），而其他细胞因子无此趋势。相关性分析显示，在所有ICI组中，FasL与IL-17A呈强正相关（relatlimab单药及联合组Spearman r分别为0.93和0.90），提示Th1/Th17轴的激活。此外，共培养上清中的IL-17A浓度与临床疗效（客观缓解率）呈正相关（Spearman r=0.42），优于PD-L1 CPS（Spearman r=0.24）。

**6. IL-17A可能构成HNSCC中反应预测的新标志物——两例病例报告**
详细分析了一例响应者（HNSCC107）和一例非响应者（HNSCC139）的临床与离体数据。响应者在nivolumab治疗下肿瘤缩小，其共培养中nivolumab诱导了高水平的IL-17A、IFN-γ和FasL，并伴随活化T细胞亚群（CD4⁺CD25⁺CD127⁺、CD8⁺CD137⁺）的扩增。而非响应者（pembrolizumab治疗）未能诱导显著促炎细胞因子升高，T细胞活化缺失且耗竭标志物（TOX）较高，与临床进展一致。

**7. IL-17A可能构成HNSCC中新型预后生物标志物**
在76例初治HNSCC患者中，根据血浆细胞因子中位值分为高低组，仅IL-17A高水平与总生存期改善显著相关（P<0.05，HR=0.4），而IFN-γ、TNF-α、IL-1β和IL-10无预后价值。在5例接受ICI治疗的患者中，IL-17A水平在治疗后升高（P=0.06 vs 治疗前），并与疾病稳定状态一致，而其他细胞因子无规律性变化。

#### 总结与讨论

该研究证明，自体外周血单个核细胞（PBMC）-患者来源类器官（PDO）共培养体系能够有效模拟头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）中ICI介导的抗肿瘤反应。平台具有快速建立、可扩展性及减少伦理限制等优势，且支持从新鲜和冷冻样本中建立PDO。约一半的病例展现出可测量的肿瘤杀伤活性，反映了HNSCC中患者间T细胞启动、抗原特异性和效应能力的异质性。Th17相关细胞因子IL-17A在抗肿瘤免疫中扮演关键角色，其与FasL的正相关性提示通过激活Fas/FasL轴增强细胞毒性。ICI处理后，PD-1和LAG-3阻断的反应呈正相关，但双重阻断未能克服耐药，表明内在ICI敏感性主要由抗原特异性T细胞的功能状态决定。LAG-3阻断显著激活细胞毒性T细胞，但保留耗竭特征（如TOX和LAG-3的表达），提示这些细胞可能通过细胞因子分泌间接参与抗肿瘤免疫。同时，IL-6和IL-10的上调表明存在负调控机制。

研究也承认几项局限性：PDO分子异质性、缺乏肿瘤驻留免疫细胞（如肿瘤浸润淋巴细胞）、缺少动态和转录组分析，以及回顾性设计和较小样本量。人类乳头瘤病毒（HPV）阳性肿瘤样本代表性不足，限制了向HPV相关HNSCC的推广。

**研究结论翻译**：研究人员建立了一种高效生成PDO的方法，为研究免疫治疗反应提供了合适的平台。在自体环境中检查肿瘤-免疫动态保留了患者间异质性，准确反映了临床条件，并促进在共临床试验框架中的反应预测。总体而言，这些结果强调了在HNSCC中由IL-17A驱动的个性化免疫治疗策略的前景。