将GPC3-CAR T细胞局部递送至一种热敏性水凝胶中，可增强其对肝细胞癌的抗癌疗效

《International Immunopharmacology》：Local delivery of GPC3-CAR T cells in a thermosensitive hydrogel enhances antitumor efficacy in hepatocellular carcinoma

　　

傅宇|陈伟斌|周圆圆|张世超|郑雄伟|刘洪毅|赵一琳

中国福建省厦门市厦门大学医学院中山医院病理学系

摘要

CAR T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中显示出显著的抗肿瘤效果，但其应用于实体瘤仍面临挑战。这主要是由于肿瘤微环境的抑制作用，这种环境阻碍了T细胞的浸润并降低了其功能。与标准的静脉注射相比，局部递送策略为CAR T细胞治疗实体瘤带来了巨大希望。然而，大多数报道的方法依赖于复杂的生物材料，并且主要应用于免疫特权组织。在这里，我们开发了一种可注射的热敏性壳聚糖/β-甘油磷酸盐/明胶（CS/G/GP）水凝胶，用于局部递送GPC3-CAR T细胞和细胞因子IL-15，以增强对实体瘤的治疗效果。这种水凝胶不仅支持CAR T细胞在体外的存活和增殖，还限制了IL-15的被动扩散，从而维持了GPC3-CAR T细胞的活性、扩增和细胞毒性。在体内NCG小鼠肝癌（HCC）模型中，水凝胶介导的局部注射显著增强了CAR T细胞在肿瘤组织中的浸润和抗肿瘤活性，且没有明显的系统毒性。总体而言，我们的水凝胶平台为局部CAR T细胞治疗提供了一种安全、可行且有效的方法，提高了实体瘤的治疗效果。

引言

嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法是癌症治疗的一种非常有前景的策略。它在血液系统恶性肿瘤中显示出显著的效果，尤其是在B细胞来源的癌症中，几种CAR T疗法已经获得了FDA的批准[1]。CAR T细胞是通过基因改造患者或供体来源的T细胞来表达识别肿瘤相关抗原的合成受体而产生的，从而实现强效和肿瘤特异性的细胞毒性[2]。尽管在血液系统癌症中取得了这些成功，但将CAR T细胞应用于实体瘤仍然具有挑战性。这主要是由于肿瘤特异性抗原的稀缺以及高度免疫抑制的肿瘤微环境，这些因素共同阻碍了T细胞的浸润并降低了其效应活性[3]。

系统给药的CAR T细胞对实体瘤的效果通常有限。传统的递送方法，如直接输注，往往导致细胞存活率低、分布不均以及在宿主组织中的滞留时间短[1]。此外，这些细胞在高度免疫抑制和纤维化的肿瘤微环境中遇到诸多障碍，从而限制了它们的迁移、浸润和扩增[4]。因此，基于生物材料的局部递送系统作为一种有前景的策略出现，可以增强CAR T细胞在肿瘤内的积累、持久性和抗肿瘤活性[5]、[6]、[7]。然而，目前的CAR T递送生物材料支架面临挑战，包括复杂的制造过程和体内安全性评估不足[8]。

基于壳聚糖的热敏性水凝胶具有优异的生物相容性和生物降解性，其独特的结构特性使其能够模拟细胞外基质（ECM）微环境[9]。这些材料已广泛用于组织工程中的药物和细胞局部递送[10]。先前的研究表明，壳聚糖/β-甘油磷酸盐（CS/GP）水凝胶支持细胞粘附和迁移，从而增强细胞活性和功能效果[11]。此外，将明胶掺入CS/GP复合水凝胶中可以为细胞-细胞和细胞-基质相互作用创造有利的环境。这种改性在机械刺激下增强了细胞锚定，并促进了细胞迁移和功能稳定性[12]。然而，目前尚不清楚这类水凝胶是否能够支持CAR T细胞在实体瘤中的存活和功能。

在这项研究中，我们通过将GPC3特异性CAR T细胞与IL-15共同封装在可注射的热敏性壳聚糖水凝胶中，开发了一种局部免疫治疗策略。该平台建立了一个支持性的免疫微环境，维持了CAR T细胞的存活、增殖和细胞毒性功能，从而增强了它们在HCC模型中的抗肿瘤活性。

章节片段

质粒构建和病毒生产

GPC3-CAR质粒是通过将hYP7 scFv、CD8α铰链区和跨膜区、4-1BB共刺激域以及CD3ζ信号域整合到pLV慢病毒载体中生成的。慢病毒上清液是通过将pMDLg-pRRE和pRSV-Rev包装质粒以及pMD2.G包膜质粒和相应的转移质粒转染到HEK-293 T包装细胞中获得的，具体方法如前所述[13]。

细胞系

HepG2、HuH7和SK-Hep1细胞系购自

GPC3-CAR T细胞在体外对HCC细胞表现出强效和特异性的细胞毒性

Glypican-3（GPC3）是一种细胞膜锚定的肝素硫酸蛋白聚糖，在70-80%的HCC病例中高表达。利用hYP7单克隆抗体对其相应GPC3表位的高亲和力，我们构建了一种第二代CAR（hYP7）质粒，专门针对GPC3（见图1A和B）。CAR表达是CAR T细胞细胞毒性效果的关键决定因素。流式细胞术分析显示，GPC3-CAR T细胞的CAR阳性率为77.1%，远高于

讨论

尽管CAR T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中显示出效果，但由于肿瘤微环境的免疫抑制作用，其在实体瘤中的应用仍然有限，这种环境限制了T细胞的浸润并损害了其功能[22]。在这项研究中，我们的结果表明，基于热敏性CS/G/GP水凝胶的递送系统增强了GPC3-CAR T细胞在HCC模型中的治疗效果。水凝胶作为局部生物材料支架，使得

结论

在这项研究中，我们开发了一种可注射的热敏性水凝胶平台，用于GPC3-CAR T细胞和IL-15的局部共递送。该水凝胶创建了一个持续的局部微环境，支持CAR T细胞的扩增、功能维持和肿瘤浸润，同时通过局部给药最小化了系统毒性。此外，IL-15的加入增强了CAR T细胞的持久性和细胞毒性，从而提高了HCC模型中的抗肿瘤效果。

CRediT作者贡献声明

傅宇：撰写——原始草稿、可视化、方法学、数据分析、概念化。陈伟斌：方法学。周圆圆：方法学。张世超：方法学。郑雄伟：方法学。刘洪毅：方法学。赵一琳：撰写——审稿与编辑、验证、监督、资金获取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了厦门市医疗重点项目（项目编号3502Z20234014）的支持。作者对提供资金和支持的机构表示感谢。特别感谢深圳深云医学免疫技术有限公司的Tony Yu博士在细胞转染技术方面的宝贵指导。