综述：电化学核酸生物传感器：推动血液诊断迈向资源有限场景下的智能医疗

《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：Electrochemical Nucleic Acid Biosensors: Advancing Blood-Based Diagnostics Toward Intelligent Healthcare in Resource-Limited Settings

　　

电化学核酸生物传感器通过将特定的生物识别事件转化为电极表面可测量的电信号（电流、电位、电容或电荷转移电阻），为先进医疗诊断提供了新途径，尤其适用于资源有限和偏远环境的即时检测（Point-of-Care, POC）。传统分子诊断平台如聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）、气相色谱-质谱联用（Gas Chromatography-Mass Spectrometry, GC-MS）、酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA）、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry, MALDI-TOF MS）及表面等离子体共振光谱（Surface Plasmon Resonance Spectroscopy, SPR）等，虽可用于识别与病毒性疾病、癌症及遗传突变相关的基因生物标志物，但其依赖专用仪器、专业操作人员、复杂样本预处理及冗长分析流程，限制了其在资源受限场景的可及性。相比之下，电化学核酸生物传感器具有操作简单、检测快速、成本低廉、便携性强、样本需求量小及特异性高等优势，能够有效应对上述挑战。

本综述系统评估了核酸生物传感器设计与实施的最新进展，重点探讨了核酸固定化策略、创新性多维探针架构以及先进的信号放大技术（目标物放大策略与信号放大策略）。此外，研究人员还批判性地分析了这类生物传感器在检测与感染性疾病、癌症及遗传性疾病相关的关键血液疾病标志物方面的实际应用。综述同时展望了这些先进生物传感器临床转化的未来前景与关键挑战，并提出了面向偏远额外的统请联系我（应该是指偏远社区和极端环境）智能且可及的医疗解决方案的战略路径。

研究指出，缓冲液中的准确性并不能保证血浆或血清中的可靠性。因此，本综述提供了从捕获探针设计、电极固定化与表面功能化、靶标结合策略、靶标与信号导向放大到血液诊断中DNA和RNA生物标志物应用的全流程路径。具体而言，DNA目标包括循环肿瘤DNA（Circulating Tumor DNA, ctDNA）/甲基化、病毒DNA；RNA目标则涵盖微小RNA（microRNA, miRNA）和信使RNA（messenger RNA, mRNA）。讨论突出了近期文献中针对血液样本电化学检测的代表性策略与研究，报道了检测时间、样本量等参数，并与标准分子方法进行了比较数据对照，以勾勒出资源有限环境下可及诊断的现实路径。

## 2. 核酸探针工程化设计

### 2.1 一维（1D）探针

单链寡核苷酸（Single-Stranded Oligonucleotide, ssDNA）探针是电化学核酸生物传感器的核心捕获元件，典型长度为10-15个核苷酸，通过硫醇-金化学在金电极表面形成自组装单分子层（Self-Assembled Monolayer, SAM）。然而，ssDNA的固有柔性及碱基与金表面的非特异性相互作用常导致无序表面层，阻碍靶标可达性并降低杂交效率。发夹探针（分子信标）通过形成茎环结构可缓解上述局限，其遇靶标后展开杂交，增强特异性并提高抗干扰能力。近期研究显示，研究人员将H1/H2发夹探针沿刚性一维支架预阵列排布，显著提升了电极界面的选择性与灵敏度。

### 2.2 二维（2D）DNA纳米结构

二维DNA纳米结构（Y形支架、DNA瓦片及DNA折纸）通过增强刚性促进有序探针取向、减少探针间相互作用、扩展分子固定容量并实现单碱基错配精准识别。Y形DNA支架可支持快速、超灵敏的检测格式，如DNA步行器（DNA-walker）和分裂适配体"摆锤"设计。Tan等研究人员开发了双圆DNA步行器检测miRNA-221，该紧凑低缠结架构容纳更多功能域，减少空间位阻，加速支点介导的链置换步行，实现约15分钟快速检测，检测限（Limit of Detection, LOD）达1.9 aM。DNA瓦片提供优越的结构柔性与骨架刚性，Kong等基于双交叉（Double-Crossover, DX）DNA瓦片构建信号探针，通过双链特异性核酸酶（Duplex-Specific Nuclease, DSN）循环生成二硫键连接捕获链，密集固定亚甲蓝（Methylene Blue, MB）负载纳米管，增强方波伏安法（Square Wave Voltammetry, SWV）电流；谷胱甘肽（Glutathione, GSH）通过硫醇-二硫键交换切割释放纳米管，实现界面再生。DNA折纸通过数百个短钉链折叠长支架成可寻址形状，Jeon等设计的DNA折纸"睡莲"圆盘通过双链DNA连接子固定于金表面，靶标结合后结构闭合使MB报告基团靠近电极，产生极高电化学信号增益，实现亚皮摩尔链霉亲和素检测。

### 2.3 三维（3D）DNA纳米结构

四面体DNA纳米结构（Tetrahedral DNA Nanostructures, TDNs）由短寡核苷酸通过一锅退火合成，具有四个双螺旋边和顶点未配对核苷酸，几何刚性与设计灵活性兼具。Duan等报道的TDN辅助电化学检测中，刚性TDN组织捕获探针于可控间距，结合掩蔽发夹抑制野生型干扰及三维杂交链反应（Three-Dimensional Hybridization Chain Reaction, 3D-HCR）构建生物素富集DNA网络用于辣根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase, HRP）加载，实现单分子错配特异性和1 aM超灵敏ctDNA检测。球形核酸（Spherical Nucleic Acids, SNAs）以纳米颗粒为核心、烷基硫醇连接DNA形成三维径向壳层，具有高局部探针密度、更快杂交动力学及改善的核酸酶耐受性；Xiang等开发的夹心电化学外泌体miRNA传感器（SEEmiR）利用肽核酸（Peptide Nucleic Acid, PNA）中性单层捕获靶标，预杂交SNA完成PNA-miRNA-SNA桥接，实现49 aM检测限。

DNA凝胶作为水合抗污三维基质，可预浓缩靶标并促进电极直接扩增。纯DNA凝胶由设计X-/Y-/T-接头或RCA/HCR产生超长链构建；杂交DNA凝胶将DNA交联剂引入聚合物或纳米材料以增强机械稳健性或额外功能。Zhang等将Cas12a整合入RCA构建DNA水凝胶，超长线性ssDNA链交联成多孔网络预包封报告分子，靶标激活Cas12a反式切割驱动凝胶-溶胶转变快速释放负载物，结合重组酶聚合酶扩增（Recombinase Polymerase Amplification, RPA）可在<2 h内以10 copies μL^-1灵敏度检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus, MRSA）mecA基因。

## 3. 电化学核酸生物传感器的表面功能化与探针固定化

### 3.1 表面改性

自组装单分子层（SAM）是金表面分子定义电化学生物传感器界面的标准途径。烷硫醇通过Au-S键及侧链相互作用自发形成有序致密层，通过改变链长、端基化学或使用混合SAM可调节单层密度、表面润湿性、抗污性及生物识别特性。Ferreira等开发的HER2适配体传感器采用二元SAM（适配体/MCH）和三元SAM（适配体/十六烷二硫醇（Hexadecanethiol, HDT)/MCH），三元SAM增强抗污性，在无需稀释的人血清中表现可靠。电沉积原位生长薄膜或纳米结构，由电解液组成、扩散及电子转移动力学调控形貌与结晶度，直接沉积Au、Pt、Ni、Ag、Cu、Co或ZnO纳米结构可增加电活性表面积、定制表面化学并降低电荷转移电阻。电聚合形成导电聚合物薄膜，具可控厚度、孔隙率、电荷及功能性，可与纳米结构导体耦合进一步降低电荷转移电阻。

### 3.2 固定化技术

金-硫醇（Au-S）化学中，硫醇化寡核苷酸自组装于金表面形成致密有序单层，混合或多齿硫醇与抗污共吸附物增强稳定性。交联化学（EDC/NHS、戊二醛、环氧、醛-胺）创建表面与探针间稳定桥接，NH₂端DNA通过EDC/NHS常规接枝至羧基化界面形成酰胺键。点击化学，尤其铜催化叠氮-炔环加成（Copper-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition, CuAAC），提供快速 impoverished 快速、选择性和生物正交连接；电点击化学在电极原位生成Cu(I)催化剂，实现时空控制的CuAAC，支持多位点功能化。

非共价及生物亲和固定化包括物理吸附（依赖静电吸引、氢键、疏水力、π-π堆积及范德华接触）和亲和方法（生物素-亲和素/链霉亲和素，Ka≈10¹⁵ M^-1）。物理包埋将生物识别元件固定于多孔三维基质（聚合物网络、水凝胶、溶胶-凝胶）中，现代基质如导电聚合物水凝胶、PEDOT-石墨烯复合材料、金属有机框架/共价有机框架（Metal-Organic Frameworks/Covalent Organic Frameworks, MOFs/COFs）及纳米碳杂化物增强亲水性、生物相容性、抗污性及电子转移能力。

### 3.3 血液衍生样本中的生物污染

生物污染是电化学核酸生物传感器在血清/血浆中应用的核心界面限制。丰富血浆蛋白（白蛋白、球蛋白、纤维蛋白原）和血红蛋白快速吸附于裸电极或探针修饰电极，通过空间位阻、改变界面特性、掩蔽固定探针并降低杂交效率70-90%。抗污策略通过四种机制：维持水合层、创建空间位阻、产生静电排斥及工程化表面形貌。聚乙二醇（Polyethylene Glycol, PEG）或寡聚乙二醇（Oligo(Ethylene Glycol), OEG）吸引保留水分子形成稳定水合层；两性离子材料通过离子溶剂化形成更强水合层，性能优于传统PEG/OEG。表面形貌在纳米尺度调节蛋白吸附行为，但需优化涂层厚度/堆积与功能化密度，防止"过度阻断"影响传输、杂交动力学及电子转移。

## 4. 靶标识别机制与报告探针

### 4.1 序列特异性杂交

序列特异性杂交利用Watson-Crick碱基配对实现互补DNA/RNA靶标精准识别。电化学杂交检测采用指示剂法或非指示剂法：非指示剂法依赖核碱基固有电活性（如鸟嘌呤氧化）或电化学阻抗谱（EIS）测量结合后法拉第阻抗变化；指示剂法采用电活性标记物增强单双链DNA区分，包括自由扩散外部指示剂（亚甲蓝、钌配合物、二茂铁）或共价连接氧化还原标记。

### 4.2 适配体介导的亲和结合

适配体（≈15-100 nt）通过指数富集配体系统进化（Systematic Evolution of Ligands by EXponential Enrichment, SELEX）技术筛选获得，可折叠成发夹、茎环、G-四链体或分裂基序，靶向结合离子、小分子、蛋白及细胞。电化学适配体传感器中，靶标结合通常诱导构象变化重新定位氧化还原标签或改变界面结构，调节电子转移效率产生信号开启/关闭读数。

### 4.3 DNA酶

DNA酶（脱氧核酶）将可编程结合臂与催化核心配对，常为金属离子激活（Mg²⁺、Zn²⁺、Pb²⁺），实现特定可切换催化。电化学生物传感器中，靶标诱导切割或连接通过氧化还原标记物（MB/Fc）释放/靠近、嵌入剂结合位点创建或基于周转的信号增益实现转导。

### 4.4 信号转导机制

选择性结合常仅产生微小电信号变化，需信号转导放大。经典氧化还原标记策略利用线性寡核苷酸末端氧化还原标签（MB、Fc、蒽醌），通过靶标诱导构象变化改变标签与电极距离调制电子转移，通常以SWV或DPV测量。双链内报告方案将识别与转导解耦，在捕获后形成的双链中插入或共价连接氧化还原报告分子，提高稳定性、准确性和定量性能。无标记阻抗法中，杂交改变界面厚度和电极介电特性，产生可测量的电荷转移电阻或电容变化，无需氧化还原标记，利于试剂简化和POC应用。

## 5. 多重电化学核酸传感：交叉反应性与检测架构

### 5.1 探针间交叉反应性控制

多重电化学核酸系统中，交叉反应性表现为生物交叉（探针与非靶标的非特异性杂交）和电化学信号重叠（不同报告基团的氧化还原峰不可区分）。在序列层面，通过生物信息学筛选避免探针组间部分互补、优化探针长度和熔解温度、采用高特异性捕获架构（发夹探针、支点介导链置换系统、DNA纳米结构），以及替换为PNA或锁核酸（Locked Nucleic Acid, LNA）探针降低背景电流并增加热稳定性。在检测架构层面，空间隔离（多电极阵列）将不同靶标捕获于空间分辨电极；正交信号编码使每个靶标关联不同电化学读出窗口，如单电极多重E-DNA传感器中使用化学正交氧化还原报告分子（蒽醌、亚甲蓝、二茂铁）产生分离良好的伏安峰。

### 5.2 同步定量多靶标检测策略

正交电化学编码在单电极表面使用不同电位氧化还原的标签检测多靶标，金属离子/纳米晶体编码（ZnS、CdS、PbS、CuS纳米颗粒）作为氧化还原探针在负电位产生分离电流峰；或靶标特异性DNA探针标记不同氧化还原分子产生可区分峰。空间分辨多重检测使用多电极阵列或图案化微点，每个电极功能化其自身受体作为独立通道读取，减少共享界面探针干扰。载体区室策略通过物理隔离信号发生器，如脂质体携带不同报告分子实现多重检测。

### 5.3 临床或复杂基质中的证据

虽多数多重电化学核酸生物传感器仍处于概念验证阶段，若干平台已报告临床或类临床样本（唾液、血清、全血）中的初步多重检测数据，证明其灵敏度和特异性可与PCR、培养、ELISA等标准临床方法媲美，但大规模多中心验证仍有限。

## 6. 电化学核酸生物传感器中的信号放大策略

早期临床样本含极低拷贝DNA/RNA生物标志物，界面杂交产生的电化学信号需额外放大以实现飞摩尔至阿摩尔级检测。放大方案分为两个轴向：（i）靶标放大（杂交前）方法，在捕获前或捕获期间增加核酸丰度；（ii）信号放大（杂交后）方法，在结合后放大电化学读出。

### 6.1 靶标放大策略

**酶促方法**：聚合酶链式反应（PCR）仍是强大扩增方法，但其依赖热循环设备限制现场部署。等温指数扩增方法如环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification, LAMP）、指数扩增反应（Exponential Amplification Reaction, EXPAR）和依赖解旋酶扩增（Helicase-Dependent Amplification, HDA）在恒定温度（通常60-65°C）运行，使用特质酶、多引及Bst聚合酶链置换活性产生大量DNA，消除热循环实现快速检测。等温线性扩增如滚环扩增（Rolling Circle Amplification, RCA）和链置换扩增（Strand Displacement Amplification, SDA）提供线性增益，扩增产物保持单链确保捕获探针高效 interrogation。

**非酶促方法**：杂交链反应（HCR）中，单链靶标打开发夹H1暴露粘性末端，交替触发H2→H1→H2…杂交构建长双链DNA聚合物；催化发夹组装（CHA）提供催化周转，触发物启动H1/H2杂交后释放并重新进入循环。Ma等设计的CHA驱动双氧化还原编码标签（MB/Fc）封装于MOF-G-四链体载体的多重电化学传感器，实现突变同步读出，灵敏度达~0.025-0.097 fM。

### 6.2 信号放大策略

**酶促方法**：核酸酶辅助靶标回收通过序列特异性磷酸二酯键切割实现靶标或报告分子催化周转，如Exo III、FEN、DNase I、切口核酸酶和DSN驱动杂交DNA/RNA的催化周转。Qu等设计的分子间"DNA轮"传感器利用切口核酸酶（Nt.CviPII）酶促抑制背景同时回收靶标形成多重轮靠近电极，实现10 aM检测限。CRISPR相关核酸酶（Cas12/13/14）添加可编程识别与反式切割；DNA酶作为无酶放大器，单个DNA酶可切割多个底物分子。

**非酶促方法**：纳米材料作为电极材料（纳米结构金、碳纳米管、石墨烯）、载体（AuNPs、碳纳米结构、磁颗粒、MOF）、催化剂（金属纳米颗粒、量子点多位点催化）、示踪剂/信号标签（氧化溶解释放金属离子）。Yan等报道的双生物标志物电化学适配体传感器结合MoS₂修饰电极与SiO₂纳米探针，实现正交电化学编码多重检测。

### 6.3 检测特异性与非特异性扩增控制

无模板对照（NTC）量化非特异性扩增或基质干扰产生的背景信号；阴性基质控制使用健康供体血清/血浆确认生物流体本身不产生假信号；内置阴性控制如Cas12a-based内部对照非特异性降解非特异性RCA产物；阳性/参考对照确认检测功能。临床诊断中，关键疾病诊断（HIV、癌症标志物等）要求特异性>99%，假阳性率<1%。

## 7. 电化学核酸生物传感器在血液疾病标志物检测中的应用

### 7.1 DNA检测

**循环肿瘤DNA（ctDNA）**：ctDNA是肿瘤细胞释放的循环游离DNA小片段，携带肿瘤特异性基因组特征，浓度通常<0.1%至>90%总cfDNA，半衰期15分钟-2.5小时。检测挑战在于极低浓度与高碎片化，需高亲和力探针（LNA或突变特异性寡核苷酸）结合超灵敏信号放大。Huang等结合双酶辅助靶标回收与HCR，实现2.3 fM检测限；Long等构建AuNPs/rGO/DNA步行器/Fe单原子碳点三重放大平台，实现1.26 aM检测限；Qu等利用Ag⁺负载DNA纳米球解离与Cu²⁺阳离子交换两级级联放大，达0.3 aM灵敏度。

**病毒DNA**：检测重点在于快速特异性检测保守基因组序列，侧重速度、稳健性和现场部署性，常结合LAMP或RPA等温扩增及CRISPR/Cas系统。Yang等设计双酶驱动CRISPR/Cas12a电化学基因传感器用于HBV检测，实现10.28 aM检测限；Enebral-Romero等利用MoS₂锚定直立四面体DNA探针的迷你电化学DNA传感器检测SARS-CoV-2，达5.0 fM检测限。

**基因组DNA甲基化**：DNA甲基化传感依赖甲基化与未甲基化胞嘧啶的化学或酶学区分。Zhang等开发无亚硫酸氢盐平台，使用工程化TALE蛋白作为甲基化选择性识别器结合多级核酸级联扩增，实现~0.5 fM检测限；Bhat等采用喷嘴喷射可打印低成本格式量化5-hmC。

### 7.2 RNA检测

**微小RNA（miRNA）**：miRNA长度18-25 nt，血清中浓度200 aM-20 pM，检测挑战在于超短转录本识别、家族成员序列同源性及缺乏多腺苷酸化。Wang等设计的触发式探针层-局部HCR平台检测miR-133a，LOD为2.21 aM；Shen等引入自供能生物传感器结合CHA和HCR累积放大miRNA-141信号；Zhou等报告多路平台整合三锁DNA逻辑器件抑制CHA泄漏与纳米材料增强信号增益，适用于临床基质。

**信使RNA（mRNA）**：mRNA检测代表转录本定量问题，关注基因表达水平测量。Cheng等报道的邻近依赖于表面HCR均相电化学生物传感器检测存活素mRNA，实现3 fM检测限；Sheng等开发的CRISPR/Cas13a催化电化学生物传感器（COMET）结合Cas13a反式切割与无酶催化发夹DNA电路，实现50 aM检测限；Hanpanich等开发的无标记、无扩增、等温电化学传感器使用多组分核酸酶（Multicomponent Nucleic Acid Enzyme, MNAzyme）检测HPV-16 E6/E7 mRNA，添加人工伴侣（PLL-g-Dex）加速杂交，将LOD从2.6 pM改善至0.88 pM。

## 8. 面向空间、植物及地球偏远社区的新格式生物传感器

植物生长、人类太空探索与地球偏远社区对电化学传感器有共同需求：实时检测快速动态变化、非侵入性、一次性、紧凑设计、高灵敏度和原位响应。精准农业中，电化学传感器提供实时现场化学智能，超出物理传感器和成像能力。太空诊断平台需符合监管要求，具备便携性、可穿戴性和非侵入性，如rHEALTH ONE微流控分析仪设计用于太空飞行，10 μL样本量、10 μs单分析速度。3D打印塑料流体生物传感器在2017年VITA太空任务中于国际空间站验证皮质醇分析准确性。

## 9. 总结与展望

电化学核酸生物传感器在肿瘤、癌症和病毒感染性疾病的核酸生物标志物检测领域取得快速进展，研究人员成功整合多种纳米材料和灵活DNA辅助扩增方法，实现改进的稳定读出、卓越灵敏度和多功能性。然而，临床转化仍面临挑战：（i）多数传感器使用纯合成核酸序列，缺乏复杂临床样本验证；（ii）可靠性、一致性及监管标准需进一步满足；（iii）个体癌症标志物特异性调控机制理解不足；（iv）单链捕获探针易碎，固定化一致性影响杂交效率；（v）无标记方法背景噪声和假阳性显著；（vi）太空及极端环境系统性资格认证有限；（vii）AI/ML在探针设计、信号解释方面潜力大但模型过拟合、可解释性不足；（viii）基质复杂性导致缓冲液性能难以转化至未稀释血清/血浆。

未来研究方向包括：开发高灵敏、精确、紧凑、便携且经济的生物传感器；多重核酸生物标志物同步检测；3D打印技术用于POC设备；创新纳米材料集成增强特异性和灵敏度；微流控芯片技术、移动网络和物联网加速远程数据管理；AI辅助分析改善信号去噪、基线校正和特征提取。电化学核酸生物传感器在医疗保健、临床诊断、治疗和药物领域具有广阔应用前景，在癌症和感染性疾病诊断方面展现出巨大潜力。