《TRAC-TRENDS IN ANALYTICAL CHEMISTRY》：Engineering gRNA for CRISPR biosensing: chemical, structural, and programmable designs for ultrasensitive diagnostics
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CRISPR-Cas系统已成为强大的生物传感平台，可实现高灵敏度与高特异性的核酸检测。该类检测的性能关键取决于向导RNA（guide RNA, gRNA）的设计，其决定靶标识别并激活顺式（cis-）与反式（trans-）切割活性。然而，天然gRNA常存在稳定性
CRISPR-Cas系统已成为强大的生物传感平台，可实现高灵敏度与高特异性的核酸检测。该类检测的性能关键取决于向导RNA（guide RNA, gRNA）的设计，其决定靶标识别并激活顺式（cis-）与反式（trans-）切割活性。然而，天然gRNA常存在稳定性有限、错配区分能力弱、在临床样本基质中活性降低及旁切切割不一致等问题，限制了CRISPR传感器的诊断潜力。为克服这些限制，研究人员开发了多种gRNA工程策略，包括长度改变、结构重构、DNA修饰策略、化学修饰、错配设计以及多重修饰。这些修饰显著提升了Cas12a、Cas13a及新兴CRISPR效应蛋白的检测灵敏度、特异性、稳定性与可编程性。本综述系统总结了近期进展，比较了机制原理与功能结果，并展望了理性gRNA工程的未来机遇，旨在实现无扩增检测、提升临床稳健性，并推动下一代CRISPR诊断技术的发展。
1. Introduction
CRISPR-Cas系统是原核生物的适应性免疫机制，通过序列特异性识别与切割抵御外源核酸入侵，分为1类（I、III、IV及VII型）和2类（II、V及VI型）系统。其中Cas9、Cas12与Cas13属于2类系统，因仅需单一效应蛋白而便于可编程设计，gRNA在其中通过间隔区与目标DNA或RNA杂交，并依赖原型间隔相邻基序（protospacer adjacent motif, PAM）或原型间隔侧翼位点（protospacer flanking site, PFS）激活功能。Cas12与Cas13在靶标识别后触发顺式和反式切割，其反式切割活性可将分子识别转化为可测信号，已广泛应用于病原体检测、突变分析及即时诊断。然而，该系统仍面临gRNA不稳定、多重检测受限、准确定量困难及对核酸预扩增依赖等问题，影响检测准确性与临床转化。
2. gRNA Modification strategies for CRISPR-Cas12a
2.1. Single gRNA modification strategies
单gRNA修饰包括长度改变（延伸与截短）、构象调控（分裂与环化）、DNA修饰（部分替换、延伸及全DNA向导）、化学修饰（光激活、甲基化、磷酸化）及错配设计。
2.1.1. Length modulation of gRNA
长度调控通过改变gRNA结构调节Cas12a激活与催化行为。5'端线性延伸（如NEXT CRISPR策略）可稳定WED/REC结构域相互作用，降低末端摆动，促进R-loop形成，提升反式切割活性，实现阿摩尔级人乳头瘤病毒16型（HPV16）检测。5'端结构化延伸（如引入RNA G-四链体RG4）可形成可逆构象门，抑制非特异性激活，在爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）检测中灵敏度提升约10倍。3'端短链DNA延伸通过优化RuvC结构域附近构象降低反式切割活化能，前列腺癌抗原3（PCA3）检测灵敏度提升400倍，侧向层析读条时间缩短至约30秒。5'端适度截短（如移除前5个核苷酸或发夹环）不影响反式切割活性，且可被靶RNA重组为功能性gRNA，实现短RNA可编程激活。
2.1.2. Conformational engineering of gRNA
构象工程通过分裂与环化调控gRNA结构。分裂gRNA将支架与间隔区分离，片段重组后可保留95%的反式切割活性，且可通过靶RNA替代间隔区实现RNA依赖的组装激活。环状gRNA通过拓扑结构增强核糖核酸酶抗性，结合尿苷酸延伸可恢复反式切割活性，环状gRNA介导的CRISPR诊断（CRCD）平台对HPV-16检测限达5 pM，临床样本灵敏度95.8%、特异性100%。NAzyme激活的环状gRNA策略（NA3C）通过酶切线性化实现条件激活，在尿路感染样本中灵敏度100%、特异性90%。
2.1.3. DNA modification of gRNA
DNA修饰包括部分替换、末端延伸及全DNA向导。部分DNA替换可降低gRNA-靶标双链热力学稳定性，加速R-loop形成，提升严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）N501Y突变区分能力。双端DNA延伸可使无乳链球菌（GBS）、HPV16/18检测限达16.6 aM，SARS-CoV-2检测限低至5 aM，且与qPCR一致性达97.5%。全DNA向导中，ΨDNA通过模拟gRNA支架的3'手柄稳定Cas12a结构，实现丙型肝炎病毒（HCV）检测准确率100%，但需预扩增且灵敏度限于皮摩尔级；crDNA通过PAM模拟双链激活RNA靶向识别，结合等温扩增后检测限达16.7 aM，在临床样本中与qPCR完全吻合。
2.1.4. Chemical modification of gRNA
化学修饰通过精确控制gRNA结构与激活提升性能。光激活修饰在间隔区引入硝基哌啉氧甲基（NPOM）保护的胸苷，阻断靶标杂交，紫外照射后恢复活性，非洲猪瘟病毒（ASFV）检测灵敏度提升50倍，SARS-CoV-2检测限达1拷贝/μL。甲基化（2'-O-甲基）修饰增强gRNA稳定性与抗降解能力，SARS-CoV-2 D614G突变检测灵敏度提升3倍。3'端磷酸化修饰通过干扰Cas12a装载抑制切割活性，碱性磷酸酶处理后恢复，可实现酶响应生物传感，碱性磷酸酶检测限低于商用ELISA试剂盒。
2.1.5. Mismatch design of gRNA
错配设计通过引入合成错配降低Cas12a错配耐受性，提升单核苷酸变异（SNV）区分能力。对称RNA（symRNA）-Cas12a策略针对SARS-CoV-2 D614G突变优化错配位置，特异性较野生型gRNA提升13倍，在复杂基质中表现优异，结合RT-RPA后检测限达10拷贝，临床样本验证可靠。
2.2. Combinatorial gRNA modification strategies
多重修饰策略通过协同调控结构完整性、变构通讯与时空激活突破单修饰局限。分裂与重组策略显示gRNA环区为可调控节点，截短环区可增强切割活性。分裂与间隔区替换策略利用靶核酸补全gRNA，实现微RNA（miRNA）无扩增检测，miR-21检测限达10 fM，并可区分成熟与前体miRNA。分裂与空间位阻策略通过小分子竞争或刺激响应连接子调控gRNA活性，实现生物素、m6A及谷胱甘肽（GSH）检测，检测限分别为10 nM、1 nM与20 pM。环区打开与触发器插入策略通过触发RNA重组功能性gRNA，SARS-CoV-2 mRNA检测限达10 fM。光控策略结合光裂解连接子实现时间控制，EBV检测限提升100倍。DNA修饰与环化策略通过脱氧尿苷（dU）位点酶切激活gRNA，特异性优于商用ELISA。末端延伸与硫代磷酸酯修饰通过增强核酸酶抗性提升稳定性，HPV18检测反式切割活性提升5倍。自催化反馈放大策略（如CONAN）通过开关式笼状gRNA（scgRNA）实现指数信号放大，PIK3CA突变检测限达5 aM，可区分0.1%低频突变；双阻断级联设计进一步降低背景，血液样本中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）检测限达200 CFU/200 μL。
3. Cas13a gRNA modification strategies
3.1. Mismatch design of gRNA
Cas13a间隔区长度与错配位置显著影响SNV区分能力，20 nt间隔区在特定位置引入错配可提升特异性，但过短间隔区会降低信号强度。合成错配策略通过引入额外错配将突变与野生型靶标的错配数差异从0/1扩大至1/2，CRISPR-based Amplification-free Viral RNA Electrical Detection（CAVRED）平台在无扩增条件下对奥密克戎变异株检测限达1拷贝/μL，8通道阵列可实现主要变异株多重鉴定。
3.2. gRNA extension strategies
5'端尿苷酸延伸可增强反式切割活性，24 nt间隔区结合5'端7U延伸使SARS-CoV-2 RNA检测限达2.36 fM，较原始gRNA提升160倍，结合RT-RPA后实现阿摩尔级灵敏度。
3.3. Conformational change of gRNA
发夹结构修饰通过茎环构象阻断非特异性相互作用，HBV检测限达1 aM且不降低灵敏度，在复杂基质中特异性提升3倍以上。折叠背（foldback）结构设计通过3'端间隔区自杂交激活HEPN结构域，实现17 nt miRNA720检测限15 fM，20分钟内完成检测。
3.4. DNA-RNA hybridization-based gRNA design
直接重复区（DR）阻断策略需低Mg2+浓度（<0.05 mM）维持ssDNA抑制效果，移除ssDNA后可恢复活性。间隔区DNA封闭子策略通过靶RNA链置换解除封闭，SARS-CoV-2变异株区分能力提升50倍，临床样本灵敏度95%、特异性100%。
4. gRNA modification in other CRISPR systems
4.1. gRNA modification of Cas9
LEOPARD策略通过重编程tracrRNA使其与靶RNA杂交形成功能性向导双链，将RNA检测转化为DNA切割信号，结合RT-PCR后检测限达1.7 aM，可实现呼吸道病毒多重检测。AGATHA策略通过分裂tracrRNA并利用转录放大信号，SARS-CoV-2 RNA检测10分钟内可见荧光，双重识别机制提升特异性。
4.2. gRNA modification of Cas12b
分裂sgRNA策略将sgRNA分为tracrDR+间隔区或tracrRNA+DR+间隔区，反式切割活性与野生型相当，顺式切割降低利于一锅法检测，miRNA无扩增检测限达26.7–37.2 fM。PUMA策略将Rptr设计扩展至Cas12b/e/f1，实现PAM非依赖性RNA检测，Cas12e检测限达0.1 nM，通用Rptr可识别5种细菌病原体。
4.3. gRNA modification of Cas12f1
组合修饰sgRNA（Cas12f_ge4.1）整合多个修饰位点，反式切割效率显著提升，PDTCTR平台结合RPA后检测限达16.8 aM，非小细胞肺癌突变识别灵敏度与特异性均达100%。TIDE-Cas14a策略引入合成错配提升SNV区分能力，PIK3CA H1047R突变检测限达0.01%变异等位基因频率（VAF），数字微流控芯片可进一步提升至0.001% VAF。
5. Conclusion and outlook
当前gRNA工程策略虽显著提升CRISPR检测性能，但仍面临靶标依赖性、临床基质稳定性不足、预扩增依赖及标准化缺失等挑战。未来需开发耐核酸酶修饰（如硫代磷酸酯、2'-O-甲基）、可控激活设计及人工智能辅助的理性优化方法，结合微流控与电化学读出技术，推动无扩增、多重、定量的即时诊断平台临床转化。持续创新分子工程与器件集成将加速下一代可编程CRISPR生物传感器的发展。
