使用分析物-DNA偶联物和多重氧化还原标记的无校准性激素检测的灵敏DNA领结传感器

《ACS Measurement Science Au》：A Sensitive DNA Bowtie Sensor for Calibration-Free Sex Hormone Detection Using Analyte-DNA Conjugates and Multiple Redox Labels

　　

报告了使用模块化和可重构的基于DNA的领结传感器结构在电化学（EC）生物传感方面的几项进展。通过一种新型氧化还原报告子设计，其中的DNA链用五个亚甲基蓝分子（MB₅）进行修饰，而不是典型的单个标签（MB），并且柔性间隔基进一步改善了信号，原始电流和灵敏度提高了高达13倍。利用领结传感器的模块化，通过酶促连接将定制合成的分析物-DNA偶联物（睾酮-DNA、雌二醇-DNA和孕酮-DNA）和对照链（地高辛-DNA）整合到电极表面的完整DNA结构中。在结合抗体后，每个传感器均显示出使用MB₅标签的电流增强，并且响应一致地遵循Langmuir曲线。使用MB₅在低频方波伏安法下观察到一种以前无法获得的信号开启响应——持续电流在更长时间内保持，从而能够进行新的差分信号校正。直接抗体传感的检测限（LOD）对于抗地高辛抗体（对照系统）低至0.08 nM（80 pM）。研究人员基于分析物、抗体和电极表面之间的非耦合平衡建立了一个数学模型。在将模型训练于结合曲线后，可以实现小分子激素的无校准测量，观测到的睾酮、雌二醇和孕酮的LOD分别为0.2、0.8和1 nM，延伸至人类临床范围。例如，睾酮传感器的范围为200 pM至70 nM，覆盖了女性（0.52至2.43 nM）和男性（9.0至34.7 nM）的临床范围，并且在50%人血清中传感器具有90%的回收率。这项工作扩展了EC领结传感器的用途，采用定制合成有机方法引入新的分析物-DNA偶联物，并进一步验证了传感器的通用性，同时开发了一种独特的结合机制模型。除此之外，新引入的MB₅标签应可与一系列其他基于DNA的EC传感器或基于适配体的传感器配合使用。

论文解读文章：

**研究背景与问题**

性激素（如睾酮、雌二醇和孕酮）在调控生殖系统及多种生理功能中起关键作用，其水平异常与多种疾病相关。目前临床测量的金标准是同位素稀释液相色谱-串联质谱法（ID-LC-MS/MS），但该方法流程复杂、耗时，需要繁琐的样品前处理。传统的免疫测定法在临床实践中常出现不一致性。因此，亟需一种更简单、快速且灵敏的电化学（EC）传感方法。基于DNA的电化学生物传感器具有潜力，但现有结构如适配体传感器受限于适配体筛选成本高、对许多临床相关分析物不可用，且通常不适用于低pM或nM范围的分析物。为此，研究人员开发了模块化、可重构的DNA领结传感器，旨在实现通用性、高灵敏度和无校准的小分子激素检测。

**研究内容与结论**

研究人员在《ACS Measurement Science Au》上发表了此项工作。通过引入多种创新，成功实现了对睾酮、雌二醇和孕酮三种性激素的无校准电化学检测。关键进展包括：采用新型多重氧化还原标记物（MB₅），使原始电流和灵敏度提高高达13倍；使用柔性聚乙二醇（PEG）间隔基进一步改善信号；通过定制有机合成方法制备分析物-DNA偶联物，并通过酶促连接整合到领结结构中；建立了基于非耦合平衡的数学模型，实现了无校准测量。传感器在缓冲液和人血清中均表现出良好性能，检测限覆盖临床范围，例如睾酮传感器范围为200 pM至70 nM，在50%人血清中回收率达90%。该工作验证了领结传感器的通用性，并表明MB₅标签可推广至其他基于DNA的EC传感器。

**关键技术方法**

研究人员采用了以下主要关键技术方法：1）采用光刻技术在镀金玻璃（GoG）上制备直径2 mm的金电极阵列；2）通过硫醇-DNA自组装单层固定DNA，随后利用T4 DNA连接酶将硫醇-DNA、分析物-DNA偶联物和MB₅标记的信号DNA进行表面酶促连接，构建完整领结结构；3）使用方波伏安法（SWV）在4至900 Hz频率范围内进行电化学测量，并通过非法拉第基线扣除和Lovric分析处理数据；4）基于Langmuir结合模型和两步非耦合平衡（溶液中的抗体-分析物结合与表面抗体-领结结合）建立数学模型，用于无校准浓度计算。样本队列来源为商业获取的预先筛选人血清（BioIVT）。

**研究结果**

**Generalizable Sensing with a Modular DNA Bowtie**：通过模块化设计，将不同分析物-DNA偶联物（睾酮、雌二醇、孕酮）替换中央链，成功构建了针对三种激素的领结传感器。结构中的氧化还原标记位置与靶标无关，抗体结合后通过减缓标记的束缚扩散引起电流变化。

**Signaling with Multiple Internal Redox Labels**：使用MB₅标签（五个亚甲基蓝分子）替代单MB标签，使直接抗体传感灵敏度提高约13倍（从10 ± 1 nA nM^-1增至130 ± 10 nA nM^-1），间接免疫传感灵敏度提高8倍（从5 ± 1 nA nM^-1增至42 ± 6 nA nM^-1）。原始电流从约400 nA增至近2.5 μA。

**Antibody Binding Response of the Bowtie Sensor**：以地高辛修饰的领结传感器为对照，MB₅标签首次引入了非响应频率（f_NR，约50 Hz），在低频（¹）下实现信号开启响应，高频下为信号关闭响应。通过差分分析获得表面覆盖度（θ）并符合Langmuir曲线，抗地高辛抗体的LOD为0.08 nM（80 pM）。

**Using Flexible Spacers to Further Improve Sensor Performance**：用1-PEG间隔基（约2.8 nm）替代4A间隔基（约2.9 nm），使MB标记的基线电流提高29%，MB₅标记的基线电流提高59%。抗体结合后电流下降百分比（约60-70%）不受影响，表明PEG间隔基未干扰抗体结合。

**Analyte-DNA Conjugate Synthesis and Initial Testing**：通过定制有机合成制备了三种分析物-DNA偶联物，关键是要选择合适的生物缀合位点。睾酮采用3位修饰，孕酮采用11α位修饰，雌二醇采用17β位修饰，并筛选出相应高亲和力抗体。初始测试表明，使用MB₅标签的传感器对抗体结合响应良好。

**Testosterone Sensing with the Bowtie Sensor**：睾酮领结传感器在抗体结合时显示高频信号关闭（灵敏度130 ± 10 nA nM^-1）和低频信号开启（灵敏度4.5 ± 0.6 nA nM^-1），差分覆盖度拟合Langmuir曲线，LOD为0.2 nM。间接免疫测定中，模型拟合得到抗体-睾酮解离常数（K_D）为4.9 nM，LOD为0.2 nM。在50%人血清中，回收率为90 ± 10%，比色灵敏度略有降低但仍在误差范围内。

**Testosterone Sensing in Human Serum**：传感器动态范围覆盖男性和女性临床范围（200 pM至70 nM）。研究表明，性激素结合球蛋白（SHBG）会竞争结合睾酮，但加入10倍过量雌二醇可置换SHBG结合的睾酮，提示可测量生物可利用或总睾酮。

**Estradiol Sensing with the Bowtie Sensor**：雌二醇领结传感器抗体结合LOD为0.6 nM，间接测定中模型拟合得到K_D为0.07 nM，LOD为0.8 nM。MB₅标签显著降低方差，使校准可靠，而单MB标签因电流低导致高方差不可靠。无校准测量验证成功。

**Progesterone Sensing with the Bowtie Sensor**：孕酮领结传感器间接测定LOD为1 nM，动态范围延伸至约40-50 nM，覆盖黄体期女性临床范围（6.4至79.5 nM）。模型提取表面负载Γ_BS,0为1.2 pmol，无校准测量验证成功。

**Study on Cross-Reactivity**：交叉反应性测试显示，除抗孕酮抗体与睾酮-DNA领结有62%交叉反应外，其他配对均无显著交叉。建议对女性样品中睾酮测量前先去除孕酮。

**总结讨论与结论**

讨论部分强调了MB₅标签的多重优势：大幅提高电流、降低方差、首次实现信号开启/关闭和差分传感，从而支持数学模型的建立和无校准测量。该标签可推广至其他基于DNA的EC传感器。在临床传感方面，领结传感器相比金标准ID-LC-MS/MS方法极大简化了工作流程，比酶增强免疫测定更简单。SHBG研究表明可通过简单修改工作流程测量生物可利用或总睾酮。未来工作需用金标准方法验证真实临床样品，并研究SHBG对其他激素传感器的影响。传感器可小型化、多路复用和便携化以适应即时检测（POC）需求。

**结论翻译**：从生物分析角度，这项工作进一步证实了EC领结传感器的模块化和通用性，同时引入了若干新特性以显著改善传感器性能。定制合成的分析物-DNA偶联物用于创建针对小分子激素测量的独特传感器适配。柔性PEG表面间隔基提供了更快的束缚扩散并增强电子转移速率。或许最具广泛影响力的发展是新型MB₅-DNA标记的引入。该标记大幅增加了原始电流并降低了传感器方差，使得仅通过简单的基于结合的电化学传感器（即无任何酶促或化学扩增）即可实现皮摩尔范围的小分子激素传感。鉴于此处观察到的增强，一个推论是MB₅标记应可用于增强利用DNA结构的各种其他EC传感器（如适配体传感器、E-DNA支架传感器、空间位阻测定或分子摆传感器）的响应。领结传感器的响应也在机理上由于MB₅得到增强，首次在该平台上实现了信号开启、信号关闭和差分传感。利用这种稳健的响应，开发了新的数学模型，并首次实现了领结传感器的无校准传感。未来可通过数学模型进一步调整每个传感器的响应，并在校正表面负载和结合亲和力后优化抗体浓度，以将传感器的最佳灵敏度移至低浓度或高浓度范围。在临床传感领域，这项工作引入了一种新的更简单的定量睾酮、雌二醇和孕酮的方法。与金标准ID-LC-MS/MS方法相比，领结传感器的工作流程大大简化，并且仍比酶增强免疫测定格式更简单。关于SHBG与睾酮相互作用的研究表明，这些传感器可重新配置以测量生物可利用睾酮、总睾酮或两者。然而，未来工作应重点使用金标准ID-LC-MS/MS或其他免疫测定系统验证领结传感器在分析真实临床样品时的性能，并应进行关于SHBG对其他激素传感器影响的研究。本质上是一种电化学测量，领结传感器未来可实现小型化、多路复用和便携化，以适应即时检测需求。