IMFrag：一种在离子淌度启用的数据非依赖采集工作流中识别源内碎裂的工具

《Analytical Chemistry》：IMFrag: A Tool to Recognize In-Source Fragmentation in Ion Mobility-Enabled Data-Independent Acquisition Workflows

　　

高分辨率质谱（high-resolution mass spectrometry, HRMS）是非靶向分析的强大工具。然而，源内碎裂（in-source fragmentation, ISF）可能导致非靶向代谢组学或暴露组学研究中化合物的错误鉴定。为了防止错误鉴定并通过MS/MS谱库匹配加强化合物鉴定，研究人员开发了IMFrag，一种基于Jupyter notebook的工具，利用从离子淌度-质谱（ion mobility-mass spectrometry, IM-MS）获得的结构信息作为正交技术，区分独立前体离子与通过ISF形成的碎片。研究人员首先检查了L-色氨酸（l-tryptophan），这是一种在电喷雾电离（electrospray ionization, ESI）过程中发生广泛碎裂的必需氨基酸。离子淌度启用的数据非依赖采集（IM-enabled data-independent acquisition, IM-DIA）分析揭示了在不同仪器位点形成的相同碎片离子具有独特的淌度特征，从而能够区分在IM漂移管之前产生的ISF与通过迁移后碰撞诱导解离（postmobility collision-induced dissociation）产生的碎片。在结构多样的小分子集合中也观察到了类似模式。从IM-DIA工作流中还可以推断出额外的结构信息，例如独特的二聚体、质子化位点以及从LC-MS单独分析不明显的不同离子类型。这些见解在应用于健康人血浆样本时被证明是有用的，该样本作为更复杂且具有生物学相关性的基质，包含共洗脱、同量异位候选结构等模糊情况。因此，IMFrag被开发为一个可访问的框架，用于查询非靶向数据集中的MS1和迁移后MS2（post-IM MS2）化学特征，并可整合到非靶向分析流程中，或用于支持开发源自ISF的MS/MS谱库。

**论文解读文章**

**研究背景与问题**

高分辨质谱（HRMS）是非靶向代谢组学和暴露组学分析的核心工具，能够同时检测数千种小分子。然而，源内碎裂（ISF）在电喷雾电离（ESI）过程中频繁发生，导致产生看似独立前体离子的碎片，容易造成化合物错误鉴定。已有研究表明，ISF在典型LC-MS/MS数据集中可占观测峰的70%以上，即使复杂生物样本中也约有10%的MS1特征来源于ISF。现有ISF识别工具如ISFrag和AntDAS主要基于LC共洗脱和MS/MS谱相似性，但均未利用离子淌度（IM）提供的正交分离维度。IM-MS可以依据气相离子的大小、形状和电荷进行快速分离，并通过漂移时间对齐区分不同来源的碎片。本研究旨在利用离子淌度启用的数据非依赖采集（IM-DIA）工作流，开发一种能够系统识别ISF并重建碎片-前体关系的工具IMFrag。论文发表在《Analytical Chemistry》。

**主要关键技术方法**

研究人员采用Waters Synapt XS Q-TOF质谱仪进行液相色谱-离子淌度-质谱/质谱（LC-IM-MS/MS）分析，使用HDMSE（DIA）模式，在迁移后碰撞诱导解离（CID）条件下同时采集低能（MS1）和高能（MS2）扫描。IMFrag工具基于Jupyter notebook，整合数据转换（.raw到.h5格式）、LC峰提取、MS1和MS2 mobilogram（淌度谱图）构建、峰检测，并通过漂移时间分辨率（Rs）和Pearson相关系数评估碎片-前体关系。样本包括30种结构多样的小分子标准品（来自ToxCast库）和健康人血浆样本（n=5，来自华盛顿大学，经伦理批准和知情同意）。通过L-色氨酸验证IM-DIA中的淌度特征，并利用Mobilogram过滤技术从复杂基质中推断前体信息。

**研究结果**

**1. In-Source Fragments Exhibit Distinct Gas-Phase Mobility Behavior**

通过L-色氨酸（Trp）实验，研究人员发现ISF在IM-DIA中呈现特征性淌度行为。在未加碰撞能时，m/z 144（[M+H-NH₃-CO₂]⁺）在MS1中仅有一个早到达的迁移峰，表明其在IM漂移管前形成。当在迁移后区域添加碰撞能时，出现第二个晚到达的迁移峰，其漂移时间与m/z 188（[M+H-NH₃]⁺）一致，证明该碎片通过后迁移CID从前体产生。这表明相同碎片离子在不同仪器位点形成时可被IM分辨，为区分ISF提供基础。

**2. Development of IMFrag**

基于上述观察，研究人员开发了IMFrag工作流。通过对30种化学标准品（包括农药、药物等）的IM-DIA分析，87%显示ISF证据。例如，阿托伐他汀（m/z 559）和戊唑醇（m/z 284）的Mobilogram中，前体与候选ISF在MS1维度完全分离，而MS2中出现的后迁移群体与前体对齐。对于环丙沙星和沙拉沙星，IM-DIA还揭示了不同的质子化位点（N-质子体和羰基O-质子体）以及独特的二聚体信息，这些从LC-MS/MS单独分析难以推断。部分小分子（如喹草酸，loss of H₂O）因碰撞截面差异小而无法完全分辨，但可通过LC共洗脱和谱相似性辅助识别。

**3. Evaluation of IMFrag**

对30种标准品进行定量评估，IMFrag正确识别所有完整前体为ISF阴性（特异性100%），且成功识别所有已知ISF（敏感性100%）。对于喹草酸（m/z 241）等因IM分离不足的案例，IMFrag仍能通过LC和MS2谱相似性正确标记ISF。在所有标签ISF中，除喹草酸因前体强度低且迁移未分离外，均成功检索到预期前体离子。

**4. Recognizing In-Source Fragments in Complex IM-DIA Workflows**

在健康人血浆样本中，研究人员聚焦于m/z 144特征。同位素模式推测为C₁₀H₉N，候选结构包括L-色氨酸的ISF（[M+H-NH₃-CO₂]⁺）以及甲基喹啉（MQ）异构体和2-萘胺等环境污染物。短LC梯度下这些成分共洗脱，MS/MS谱高度相似，无法区分。通过IMFrag分析m/z 144的Mobilogram：MS1中显示单峰，MS2中显示后迁移群体。利用后迁移漂移时间窗口过滤MS1谱，得到m/z 188的强信号，证实其为L-色氨酸的[M+H-NH₃]⁺碎片。延长LC梯度后色谱分离确认，该特征在所有血浆样本中均为L-色氨酸的ISF，而非外源暴露。此外，在加标混合药物（如阿普洛尔、昂丹司琼等）的血浆中，IMFrag正确识别所有完整前体，并纠正了仅依赖LC-MS/MS时被误判为ISF的共洗脱化合物。

**讨论与结论**

讨论指出，ISMrag利用IM提供的正交维度，通过漂移时间对齐直接评估碎片-前体关系，补充了现有LC-MS工具（如ISFrag）的不足。尽管本研究使用Waters Q-IM-TOF平台，但基本原理适用于其他商业系统（如Agilent和Bruker的TWIM、DTIM和TIMS），只要采用后迁移CID即可。该方法在处理共洗脱、同量异位候选结构时尤其有效，能够从复杂基质中推断前体而不需完整分子离子观测。

**研究结论**：研究人员证明，ISF在IM-DIA工作流中表现出特征性淌度特征，能够系统地识别并将其与高质量前体关联。基于这些观察，研究人员开发了IMFrag作为可访问的框架，用于查询非靶向数据集中的MS1化学特征。IMFrag可应用于感兴趣的单个体征、整合到非靶向分析流程中，或用于支持开发源自ISF的MS/MS谱库，从而促进复杂样本中的代谢物鉴定和发现。尽管本研究使用Q-IM-TOF（Waters）平台进行，但所述基本原理与供应商无关。虽然其他供应商（如Agilent和Bruker）的商业IM-QTOF仪器在四极杆位置和IM操作原理上硬件布局不同，但IMFrag策略预计可广泛适用于采用迁移后CID的IM启用DIA工作流。重要的是，通过迁移后碎片化保留前体-碎片关系在多个商业可用平台上得到支持，包括TWIM、DTIM和TIMS。研究人员指出，类似ISF识别策略已开发并应用于缺少IM分离的常规LC-HRMS数据集。例如，R包ISFrag利用保留时间共洗脱和MS/MS谱相似性模式在非靶向工作流中进行从头ISF特征识别。在此背景下，IMFrag将这些原则扩展到IM维度，其中漂移时间（或对于TIMS的反简约迁移率）对齐为解析前体-碎片关系提供了正交且高度特异的标准。随着IM启用平台在代谢组学和暴露组学中的扩展，纳入ISF识别策略对于提高注释置信度和充分利用多维质谱的威力至关重要。