生物分子凝聚体的大小通过无定形-淀粉样蛋白竞争决定液-固相转变的命运

《Journal of the American Chemical Society》：Size of Biomolecular Condensates Dictates Fate in Liquid–Solid Phase Transitions through Amorphous–Amyloid Competition

　　

蛋白质不仅通过分子内折叠和分子间复合物形成发挥作用，还通过分子间相互作用驱动的相转变发挥作用。这些相，包括液态凝聚体（liquid-like condensates）、无定形聚集体（amorphous aggregates, AAs）和淀粉样蛋白纤维（amyloid fibrils），与不同的生物学功能和病理过程相关。尽管从液态凝聚体到淀粉样蛋白的转变已被广泛研究，但在细胞尺寸限制条件下，淀粉样蛋白与其他亚稳态固态之间的动力学关系仍不清楚，这可能阻碍有效治疗策略的建立。这一知识空白源于宏观尺度实验不可避免地导致亚稳态相转化为最稳定相。研究人员开发了一种基于液滴的微流控系统（droplet-based microfluidic system），该系统能够定量分析淀粉样蛋白成核（amyloid nucleation）和亚稳态AA形成。利用酵母朊病毒蛋白Sup35（yeast prion protein Sup35），研究人员发现凝聚体同时转化为淀粉样蛋白和AA，并且AA形成施加了一个动力学屏障（kinetic barrier），在微米尺度上以尺寸依赖方式抑制淀粉样蛋白形成，突显了尺寸效应在凝聚体-淀粉样蛋白转变中的重要性。此外，研究人员证明了众所周知的淀粉样蛋白抑制剂(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（(-)-epigallocatechin-3-gallate, EGCG）在低浓度下通过调节AA和淀粉样蛋白成核动力学，反而促进了淀粉样蛋白形成。这一现象原则上无法在宏观尺度实验中观察到，仅在当前系统的微米尺度限制下才变得明显。这些发现为细胞环境中的蛋白质相转变提供了基础性见解，并可能指导针对淀粉样蛋白原性蛋白（amyloidogenic proteins）的亚稳态聚集体开发新型治疗策略。

生物分子凝聚体大小通过无定形-淀粉样蛋白竞争决定液-固相转变命运——基于液滴微流控系统的研究解读

**研究背景与问题**

蛋白质在生命系统中通过微观状态和组装体（如折叠成天然结构及形成蛋白质复合物）执行多种功能。近几十年来，人们越来越认识到蛋白质还会经历相转变，形成介观和宏观组装体，包括液态凝聚体（liquid-like condensates）、无定形聚集体（amorphous aggregates, AAs）、晶体和淀粉样蛋白纤维（amyloid fibrils）。这些状态与生物学功能及疾病密切相关。例如，可逆的液态凝聚体相转变在基因组组织、转录和免疫应答等生理过程中发挥重要作用；而不可逆的固态相转变（如AA、晶体和淀粉样蛋白纤维）不仅参与正常生理功能（如胰岛素储存、长期记忆形成），也与多种“错误折叠疾病”相关，尤其是阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症（ALS）和透析相关性淀粉样变性。淀粉样蛋白的形成机制已被广泛研究，以期理解病理、推进药物发现和开发诊断技术。

近年来，生物分子凝聚体逐渐被视为淀粉样蛋白形成的复杂反应环境，而非简单的成核加速器。早期研究主要认为凝聚体因极高蛋白质浓度而增强淀粉样蛋白成核，但最近的观点认为凝聚体内部可能抑制淀粉样蛋白成核，同时提供界面促进异质成核。为了从物理化学角度深入理解凝聚体到淀粉样蛋白的转变，一个重要方面是研究亚稳态相（即蛋白质组装的多态性）在细胞尺寸限制下的动力学。在毫米级溶液（约10^-6 L）中，亚稳态（如凝聚体和AA）根据奥斯特瓦尔德（Ostwald）步骤规则首先形成，一旦热力学稳定相出现，亚稳态会完全转化为稳定相。而细胞可被视为孤立的微米级溶液（体积约10^-12 L），对于依赖于成核的现象（如淀粉样蛋白形成），这种小型受限系统表现出稀有和随机行为。因此，凝聚体、AA和淀粉样蛋白形成的动力学预期具有尺寸依赖性，而从毫米级系统获得的见解能否直接外推到细胞尺寸尺度仍不清楚。

**研究内容与结论**

为解决这一挑战，研究人员开发了一种基于液滴的微流控方法（droplet microfluidic approach），用于分析从凝聚体到淀粉样蛋白和亚稳态相的相转变。液滴微流控技术通过生成均匀的皮升级水包油液滴，实现了化学和生化实验的小型化和并行化。由于蛋白质分子不能在液滴间运输（类似于细胞环境），因此即使相邻液滴中出现稳定相，亚稳态相也能持续存在。此外，液滴尺寸可通过通道设计和流量控制精确调节，从而控制凝聚体尺寸——这是成核动力学中的关键参数。观察大量凝聚体中的相转变，可定量分析淀粉样蛋白成核事件。

研究人员以酵母朊病毒蛋白Sup35的NM结构域（Sup35NM）作为模型淀粉样蛋白原性蛋白。Sup35NM是研究淀粉样蛋白形成和朊病毒相关蛋白组装的成熟模型。研究结果显示：凝聚体同时转化为淀粉样蛋白和AA，且AA形成在微米尺度上以尺寸依赖方式抑制淀粉样蛋白形成。此外，众所周知的淀粉样蛋白抑制剂(-)-表没食子儿茶素-3-没食子酸酯（EGCG）在低浓度下反而通过调节AA和淀粉样蛋白成核动力学促进了淀粉样蛋白形成。这些发现为理解细胞环境中的蛋白质相转变提供了基础，并可能指导靶向淀粉样蛋白原性蛋白亚稳态聚集体的新治疗策略。该论文发表在《Journal of the American Chemical Society》上。

**主要关键技术方法**

研究人员采用的主要关键方法包括：（1）液滴微流控系统：利用流动聚焦微流控装置在70°C生成均匀的皮升级水包油液滴，随后降温至30°C形成凝聚体，油相为含1%氟表面活性剂的HFE-7500氟化油；液滴尺寸通过调节水相压力控制。（2）荧光成像与定量：使用硫黄素T（ThT）作为淀粉样蛋白荧光指示剂，通过共聚焦显微镜监测ThT荧光随时间的变化，并设定荧光强度阈值（F_thres = F_ave + 5F_σ）区分含淀粉样蛋白的凝聚体。（3）荧光漂白恢复（FRAP）测量：使用激光扫描共聚焦显微镜，以488 nm激发，测量凝聚体、淀粉样蛋白和AA的荧光恢复，评估其流动性。（4）拉曼光谱分析：使用785 nm激发测量凝聚体、淀粉样蛋白和AA的酰胺I峰，区分有序交叉β结构（cross-β）和无规卷曲结构。（5）动力学模型拟合：采用两步成核模型描述淀粉样蛋白形成，并引入n级无定形化反应（amorphization reaction）描述AA形成，通过竞争模型拟合实验数据。蛋白质来源为酵母朊病毒蛋白Sup35NM，在大肠杆菌BL21(DE3)中表达并纯化，无人类样本队列。

**研究结果**

**1. 在液滴中形成微米级Sup35NM凝聚体**

通过混合Sup35NM与5 wt%聚乙二醇（PEG, 20 kDa）在pH 7.4下形成液态凝聚体，且凝聚体形成对温度具有可逆性。利用温度依赖性，在70°C生成液滴后冷却至30°C，液滴内先出现多个凝聚体，1小时后融合为单个凝聚体。凝聚体半径（R_c）可通过液滴半径（R_d）控制，且稀相中Sup35NM浓度与液滴尺寸无关，表明相分离平衡一致。

**2. 观察从Sup35NM凝聚体形成淀粉样蛋白**

通过ThT荧光监测，大凝聚体（R_c = 7.5 μm）中淀粉样蛋白形成概率随时间增加至100%，而小凝聚体（R_c = 3.7 μm）中部分凝聚体始终未出现强ThT荧光。概率（P）在约5小时后达到平台值（P_max），且P_max随R_c减小而降低。FRAP测量显示：ThT阳性凝聚体（淀粉样蛋白）无荧光恢复（固态）；ThT阴性凝聚体在1.0-2.5 h时部分恢复，过夜后无恢复（逐渐固化）。拉曼光谱显示：ThT阳性凝聚体在1665 cm^-1处有尖锐酰胺I峰（交叉β/β-折叠）；ThT阴性凝聚体在1660 cm^-1处有宽峰（无规卷曲），类似凝聚体结构，故定义为无定形聚集体（AA）。破坏液滴后，AA数量减少而淀粉样蛋白数量增加，表明AA是亚稳态，淀粉样蛋白是最稳定相。基于此，研究人员提出竞争模型：淀粉样蛋白成核具有高能垒，AA形成具有低能垒；大凝聚体中成核时间短，优先形成淀粉样蛋白；小凝聚体中成核时间长，易完全转化为AA。动力学模型拟合表明，不含AA形成的模型无法再现实验结果，而包含竞争的模型成功拟合。

**3. 小分子通过改变AA形成动力学调节淀粉样蛋白成核**

使用EGCG（已知淀粉样蛋白抑制剂）进行实验。在宏观平板读数器中，EGCG浓度升高使ThT荧光信号降低（IC₅₀ = 47 μM）。在液滴中，大凝聚体（R_c = 7.5 μm）中ThT荧光随EGCG浓度增加而降低，且淀粉样蛋白概率（P）变化不显著（与宏观一致）。但小凝聚体（R_c = 3.7 μm）中，在EGCG浓度为0.3-30 μM时，淀粉样蛋白概率（P）反而意外升高。FRAP测量显示，加入EGCG后，ThT阴性凝聚体的荧光恢复显著增大，表明AA形成受抑制。宏观实验显示EGCG在0.3-3 μM时未影响淀粉样蛋白形成滞后时间，说明EGCG未加速淀粉样蛋白成核。因此，低浓度EGCG通过抑制AA形成，间接促进了小凝聚体中的淀粉样蛋白成核和延伸。

**讨论与结论**

讨论部分指出，本研究首次直接定量分析了凝聚体到淀粉样蛋白的尺寸依赖性，并揭示了与亚稳态AA的竞争。在常规宏观实验中，亚稳态会消失，且缺乏AA的有效分子探针。本研究的液滴系统将淀粉样蛋白和AA隔离在皮升级液滴中，使亚稳态AA得以稳定存在，从而反映动力学平衡。尽管该系统简化了细胞内多凝聚体共存的情况，但揭示了微米级与毫米级系统之间的差异，为理解细胞中相转变的作用提供了基础。考虑到细胞尺寸（数微米至数十微米）及细胞内蛋白质运输受限，液滴隔离的凝聚体更接近细胞内环境。因此，AA与淀粉样蛋白竞争并抑制淀粉样蛋白形成的现象可能在体内发生。此外，低浓度EGCG通过抑制AA形成反而促进淀粉样蛋白形成，这一现象无法从宏观实验预测，提示调节亚稳态可能是一种治疗蛋白质错误折叠疾病的新策略。

结论部分翻译如下：在本研究中，研究人员控制了微液滴内Sup35NM凝聚体的尺寸，并首次揭示了淀粉样蛋白形成依赖于凝聚体尺寸，这是由于与亚稳态AA的竞争所致。在较小的凝聚体中，单体在淀粉样蛋白成核前完全转化为AA的概率增加，从而抑制了淀粉样蛋白形成。此外，添加EGCG后，研究人员发现在低EGCG浓度下，由于AA形成受到抑制，小凝聚体中的淀粉样蛋白成核被促进。由于体内细胞间的蛋白质运输高度受限，且细胞内凝聚体尺寸通常在100 nm至1 μm之间，本研究的微流控系统比传统宏观实验更接近细胞内环境。因此，研究人员预期这些发现将为更深入理解细胞中淀粉样蛋白原性蛋白凝聚体的物理化学行为奠定基础，并可能有助于新的治疗和药物发现策略。